维生素E琥珀酸酯对MCF?7乳腺癌细胞三苯氧胺敏感性的影响
【摘要】 目的 检测维生素E琥珀酸酯（VES）对MCF?7乳腺癌细胞三苯氧胺敏感性的影响。方法 人乳腺癌细胞MCF?7以VES刺激24h，VES浓度为5μg/ml和10μg/ml。随后以1μM，2.5μM，5μM和10μM的三苯氧胺作用24h，以MTT法测定对细胞增殖的抑制作用，RT?PCR法检测VES对HER?2 mRNA表达的影响，以免疫组化法检测VES作用前后HER?2产物c?erbB?2表达的变化。结果 TAM对MCF?7乳腺癌细胞具有增殖抑制作用，VES处理后，乳腺癌细胞对TAM的敏感性升高。RT?PCR显示VES作用后乳腺癌细胞HER?2 mRNA转录水平有一定程度的下降，乳腺癌细胞c?erbB?2的表达降低。结论 VES对MCF?7乳腺癌细胞三苯氧胺的敏感性具有增强作用，可能与降低HER?2基因表达产物有关。
【关键词】 维生素E琥珀酸酯 乳腺肿瘤 三苯氧胺 敏感性
0 引言
乳腺癌是一种常见于妇女的激素依赖性恶性肿瘤，内分泌是乳腺癌综合治疗措施中的重要一环。对于雌激素受体阳性的乳腺癌常采用内分泌治疗，三苯氧胺是最常用的一线药物。但有报道指出，长期应用三苯氧胺后会使乳腺癌细胞产生耐药性从而降低对内分泌治疗的反应。本实验旨在检测新的肿瘤凋亡诱导药物VES对雌激素受体阳性的乳腺癌MCF?7细胞三苯氧胺治疗敏感性的影响，并分析其对HER?2基因表达的调控作用。
1 材料与方法
1.1 细胞和主要试剂
人乳腺癌细胞株MCF?7受赠于上海肿瘤乳腺中心，VES和三苯氧胺购自SIGMA公司。MTT为AMRESCO产品，RNA抽提试剂盒为安徽优晶公司产品，RT?PCR一步法试剂盒为Takara公司产品。
1.2 细胞培养和药物作用
MCF?7细胞以含10%小牛血清的RPMI1640培养基于37℃，5% CO2的条件下培养。VES和三苯氧胺以无水乙醇溶解，VES实验浓度为5μg/ml 和10μg/ml，三苯氧胺为1μM、2.5μM、5μM和10μM。无水乙醇在培养基内的终浓度<2‰。VES作用24h后再以不含药物的培养基培养24h，随后按照上述浓度加入三苯氧胺刺激24h，以MTT法检测药物对细胞的增殖抑制作用。
1.3 MTT法检测药物对乳腺癌细胞增殖的抑制作用
乳腺癌细胞以2×104/ml接种于96孔板，每孔200μl，每组设6个复孔。接种细胞24h后加入药物。药物处理结束后每孔加入5g/L MTT 20μl，继续于37℃孵箱培养4h后，弃上清，加入DMSO 150μl/孔，震荡5min后于自动酶标仪上进行比色，测定波长为492nm吸光值（A）。药物对乳腺癌细胞的生长抑制率。抑制率（%）=（空白对照组平均A值-实验组平均A值）/空白对照组平均A值×100%。
1.4 RT?PCR法检测VES对HER?2 mRNA表达的影响
5μg/ml和10μg/ml VES刺激MCF?7细胞24 h后，按照RNA抽提试剂盒的操作步骤抽提总RNA并根据在260nm吸光值进行定量。使用 Takara 一步法RT?PCR试剂盒检测HER?2 mRNA的表达，引物序列见表1。反应条件为：逆转录65℃，30min。 PCR反应为 30个循环 (解链94℃，30s ；退火 63℃，60s，以及延伸72℃，60s)。反应结束后在1% 琼脂糖凝胶分析逆转录表达产物。以未经VES处理的MCF?7细胞设为对照。
表1 RT?PCR反应引物序列（略）
1.5 免疫组化法检测c?erbB?2 蛋白表达
盖玻片置于6孔板内，按细胞培养条件进行细胞培养。5μg/ml和10μg/ml VES作用24h后取出玻片，丙酮固定5min。采用免疫组化链霉素亲合素—生物素化过氧化物酶标方法，经微波修复抗原，按试剂盒说明书操作，检测VES 处理前后c?erbB?2在MCF?7细胞中的表达，以未经VES处理的MCF?7细胞设为对照。细胞膜出现棕黄色颗粒的为c?erbB?2阳性细胞。采用AB值法[1]。A表示显色深浅，0为无显色，1为浅黄色，2为棕黄色，3为棕褐色；B为每个视野染色细胞比例，1为阳性细胞<1/3，2为1/3～2/3，3为>2/3。每例观察5个高倍视野计算A×B值的平均值。
1.6 统计学分析
实验数据以均数±标准差表示，用方差分析进行统计学分析。
2 结果
2.1 TAM对雌激素受体阳性乳腺癌细胞的生长抑制作用
0.2%无水乙醇对乳腺癌细胞的增殖无显著影响(P>0.05)。不同浓度的TAM对MCF?7细胞具有显著的生长抑制作用(P<0.05)，表现为剂量-依赖关系，见表2。
表2 TAM对MCF-7细胞的生长抑制作用（略）
*与空白对照相相比，P<0.05
2.2 VES对乳腺癌细胞的三苯氧胺敏感性的影响
MCF?7细胞经VES预处理24h后，对三苯氧胺的敏感性增强，表现为相同浓度和作用时间的三苯氧胺对MCF?7细胞的增殖抑制作用增强(P<0.05), 见图1。
1. TAM 1μM; 2. TAM 2.5μM; 3. TAM 5μM; 4. TAM 10μM
图1 VES对乳腺癌细胞TAM敏感性的影响（略）
2.3 VES对乳腺癌细胞HER?2 mRNA水平的影响
以NIH软件分析条带的相对灰度，HER?2/β?actin比值作为参照指标，设未经药物处理的对照组比值为1，5μg/ml和10μg/ml VES作用24h后HER?2 mRNA转录水平出现不同程度的降低，分别为0.83和0.62，见图2。
1. Marker; 2. Control； 3. VES 5μg/ml; 4. VES 10μg/ml
图2 VES对乳腺癌细胞HER?2mRNA转录水平的影响（略）
2.4 VES对乳腺癌细胞c?erbB?2表达的影响
VES处理后MCF?7细胞膜表达的c?erbB?2 较对照组降低， 见图3， c?erbB?2表达值（AB值）由对照组的5.2±0.8降至4.0±0.5和2.0±0.7(P<0.05)。
3 讨论
内分泌在乳腺癌的综合治疗中占有重要的地位。其目的是抑制雌激素依赖性肿瘤细胞的生长，其中TAM以其疗效确切、副作用少而广泛应用于各期乳腺癌的内分泌治疗。但仍有约1/3以上的雌激素受体阳性的患者对TAM治疗不敏感或无效，且原先有效的患者随着用药时间的延长，其有效率明显下降。
随着对乳腺癌和演进的分子遗传学研究的深入，人们认识到HER?2在乳腺癌内分泌治疗耐药方面可能起重要作用。HER?2（c?erbB?2）在人上皮生长因子受体（HER）家族成员中起中心作用[2]，是乳腺癌中研究最多的生长因子受体系统。研究表明，将HER?2基因转染至雌激素受体阳性的、三苯氧胺敏感的乳腺癌细胞，使HER?2过表达，结果这种乳腺癌细胞对TAM产生耐药；而采用针对HER?2细胞外区域的抗体处理HER?2过表达的乳腺癌细胞能使其对TAM和雌激素拮抗剂的敏感性增强；同时使用HER?2信号通路抑制剂和内分泌药物处理内分泌耐药的乳腺癌细胞，结果克服了对内分泌的耐药[3?5]。以上实验结果提示，以HER?2作为治疗靶点，用抗体或抑制剂的方法将HER?2信号传导途径阻断，乳腺癌细胞对TAM的治疗敏感性将增强。
维生素E琥珀酸酯（VES）是一种新的肿瘤生长抑制剂，由于其对恶性肿瘤细胞具有选择性的抑制作用而对正常细胞影响较小[6]，而且其体内的毒性较低，在恶性肿瘤治疗中的作用越来越引起人们的重视。已有研究表明，VES对乳腺癌细胞具有较强的凋亡诱导作用并表现为时间-剂量依赖性[7]。据You等[8]报道VES还具有诱导乳腺癌细胞分化的作用，在此过程中，MCF?7和MDA?MB?435乳腺癌细胞的HER?2表达产物水平降低。我们以较低剂量的VES处理乳腺癌细胞后，以RT?PCR法和 Western蛋白印迹法从mRNA和蛋白水平检测到VES具有下调HER?2表达的作用，同时发现MCF?7细胞在VES处理后对TAM的敏感性升高。以上实验结果提示VES?TAM的序贯疗法在提高乳腺癌内分泌治疗效果方面可能会有一定的作用。
【】
［1］ Shimizu M, Saitch Y, Itoh H, et al. Immunohistochemical staining of H?ras oncogenic product in normal, benign and malignant human pancreatic tissues[J]. Hum Pathol, 1990, 21(6): 607?613.
［２］ Hung MC, Lau YK. Basic science of HER?2/neu: a review[J]. Semin Oncol, 1999, 26(4 suppl 12): 51?59.
［３］ Witters LM, Kuner R, Chinchilli VM, et al. Enhancer anti?proliferative activity of the combination of tamoxifen plus HER?2?neu antibody[J]. Breast Cancer Res Treat, 1997, 42(1): 1?5.
［４］ Kunisue H, Kurebayashi J, Otsuki T, et al. Anti?HER?2 antibody enhances the growth inhibitory effect of anti?oestrogen on breast cancer cells expressing both oestrogen and HER?2[J]. Br J Cancer, 2000, 82(1): 46?51.
［５］ Johnson SR, Head J, Panchioli S, et al. Integration of signal transduction inhibitors with endocrine therapy: an approach to overcoming hormone resistance in breast cancer[J]. Clin Cancer Res, 2003, 9(1 pt 2): 524S?532S.
［６］ Neuzil J, Weber T, Gellert N, et al. Selective cancer cell killing by alpha-tocopheryl succinate[J]. Br J Cancer, 2001, 84(1): 87?89.
［７］ Yu W, Israel K, Liao QY, et al. Vitamin E succinate( VES) induces Fas sensitivity in human breast cancer cells: role for Mr 43000 Fas in VES-triggered apoptosis[J]. Cancer Res, 1999, 59(4): 953?961.
［８］ You H, Yu W, Sanders BG, et al. RRR?alpha?tocopheryl succinate induces MDA?MB?435 and MCF?7 human breast cancer cells to undergo differentiation[J]. Cell Growth Differ, 2001, 12(9): 471?480.
