阿司匹林抑制肺癌细胞增殖的实验研究

             作者：刘国华，陈燕明 ，冯一中 

【摘要】  目的 观察阿司匹林在体外对肺腺癌细胞A549增殖的抑制作用。方法 采用噻唑蓝(MTT)法观察阿司匹林及与奥沙利铂联用抑制A549细胞的增殖；采用流式细胞仪(FCM)观察阿司匹林处理后A549细胞周期分布的变化；采用HE染色和DNA末端原位标记染色技术(TUNEL)观察阿司匹林处理后诱导A549细胞凋亡的作用。结果 MTT显示阿司匹林呈剂量依赖方式抑制A549细胞增殖。阿司匹林作用后，FCM显示G0/G1期细胞比例增加，S期和G2/M期细胞比例降低，TUNEL显示细胞凋亡指数(AI)由3.67%±1.15%增加到26.33%±2.52%，呈一定剂量效应关系。光镜下可见典型的细胞凋亡形态学变化。阿司匹林(2.5mmol/L)与奥沙利铂(≥6.25ug/mL)联用可增强抑制A549增殖的作用，二者呈协同或相加作用。结论 阿司匹林可抑制肺腺癌细胞A549的增殖，其影响细胞周期分布、诱导细胞凋亡可能是其重要的机制。阿司匹林及与奥沙利铂联用有显著的协同抗增殖效应。

【关键词】  阿司匹林；肺癌；细胞增殖；奥沙利铂

    Experimental Study on Inhibitive Effecs of Aspirin on the Proliferation of Human Lung Cancer Cells

     Key words：Aspirin;Lung cancer; Cell proliferation; Oxaliplation

    近年来研究发现， 环氧化酶?2(COX?2)抑制剂可抑制结肠癌、 肝癌、 胃癌等多种肿瘤细胞的增殖， 同时与一些抗肿瘤药物合用还有协同作用[1]， 然而有关对肺癌作用的研究国内报道甚少。 本实验探讨了传统COX?2抑制剂阿司匹林(aspirin)及与肺癌化疗的一线药物奥沙利铂(oxaliplation)联用对人肺腺癌细胞A549增殖的抑制作用， 现报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  细胞株  人肺腺癌细胞株A549购自院上海细胞生物研究所。

    1.1.2  主要药品及试剂阿司匹林纯品购自Sigma公司，实验前先溶于无水乙醇，配制成1 000X浓度，再用培养基稀释1 000倍，所有实验组及对照组培养液内乙醇终浓度均<0.5%，预实验对细胞增殖没有影响。奥沙利铂由江苏恒瑞医药股份有限公司生产。RPMI?1640培养液购自Gibco公司，含10%灭活小牛血清，100u/mL青霉素及100u/mL链霉素。噻唑蓝(MTT)及二甲基亚砜(DMSO) 购自Sigma公司。RNA酶(Rnase)及碘化丙啶(PI)购自Sigma公司。原位酶标记法(TUNEL)试剂盒购自Roche公司。

    1.1.3  主要仪器  美国SHELLAB 2300型恒温CO2细胞培养箱，日本OLYMPUS BH?2型光学显微镜，美国Biotect 2550型自动酶标光度仪，美国COULTER EPICS XL型流式细胞仪等。    

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养  将肺腺癌细胞株A549置于RPMI?1640培养液中，于37℃、5%CO2培养箱内培养。

    1.2.2  MTT比色法  取对数生长期的A549细胞以每孔5×103个细胞接种于96孔板中，培养24h后换液，设实验组(加不同浓度的干预药物)、空白调零组(不接种细胞)及对照组(只含等量溶剂)，每组设四个复孔。48h后每孔加入MTT20μL，继续培养4h后1 000r/min离心5min，吸出上清液，每孔加入DMSO100μL，轻轻振荡10min，于酶标仪570nm波长处测定各孔吸光度值(A值)。细胞增殖的抑制率：抑制率=(1-实验组A平均值/对照组A平均值)×100%。计算Q值并判断两药的联合效应[2]：Q=E(A+B)/[EA+(1－EA)×EB]，其中E(A+B)为两药合用的抑制率，EA、EB为两药单用的抑制率。Q为0.85～1.15表示两药作用相加，Q>1.15表示两药作用协同，Q<0.85表示两药作用拮抗。

    1.2.3  流式细胞仪检测细胞周期分布  取对数生长期的A549细胞按1×106/瓶个细胞接种于100mL培养瓶中，培养24h后换液。实验组阿司匹林终浓度分别为5.0mmol/L、10.0mmol/L，设不加药对照组,每组每个浓度重复3瓶。48h后收集细胞，吹打成细胞悬液，PBS洗涤，1 000r/min离心5min后弃上清液，加入70%冷乙醇固定，4℃放置1h，取出后用PBS漂洗，1 000r/min离心5min后弃上清液，加入0.01% Rnase 1mL，37℃水浴温箱振荡10min，1 000r/min离心5min后弃上清液，加入0.05%碘化丙啶(PI)1mL染色，用400目筛网过滤后置于4℃冰箱，20min后上机检测。计算细胞增殖指数（PI）：PI=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%。

    1.2.4  HE、TUNEL染色法检测细胞凋亡

    (1) 细胞形态学观察  取对数生长期的A549细胞以每孔2×104个细胞接种在置有玻片的24孔培养板内，培养24h后换液。实验组阿司匹林终浓度分别为5.0mmol/L、10.0mmol/L，设不加药对照组，每组每个浓度设3个复孔。48h后取出玻片，冷丙酮固定30min，PBS漂洗，室温风吹干。作HE染色，光镜下观察。

    (2) DNA末端原位标记染色法(TUNEL)  按(1)制备肿瘤细胞玻片。48h后4%多聚甲醛固定30min，蛋白酶K消化，0.3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，加入TdT和Bio?dUTP混合液37℃孵育60min，SABC室温30min，DAB显色，苏木素复染，脱水，封片，光镜下观察。正常细胞核呈蓝色，凋亡细胞核为棕褐色。计算凋亡指数（AI）：在高倍镜（×400）下选择10个视野,分别计数凋亡细胞数和总细胞数，AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

    1.3  统计学处理

    数据以±s表示，应用SPSS12.0统计软件进行组间t检验。

    2  结果

    2.1  阿司匹林及与奥沙利铂联用对A549细胞增殖的影响  阿司匹林1.25～20 mmol/L作用A549细胞48h后细胞抑制率最低为3.96%，最高为65.49%，其作用具有剂量依赖性，差异具有显著性。根据此抑制效应结果，选用阿司匹林2.5mmol/L作为与奥沙利铂联合用药的干预浓度，见表2。由表2可见，奥沙利铂亦呈剂量依赖性抑制A549细胞的增殖，奥沙利铂浓度为6.25μg/mL时，阿司匹林与奥沙利铂联用有协同作用(Q=1.21)；奥沙利铂浓度在12.5～100μg/mL时，阿司匹林与奥沙利铂联用有相加作用(Q=0.95～1.03),见表1。表1  阿司匹林对A549细胞增殖的抑制

　　2.2  阿司匹林对A549细胞周期的影响  阿司匹林5mmol/L、10mmol/L作用A549细胞48h后使G0/G1期细胞比例增加，S期和G2/M期细胞比例降低，同时增殖指数（PI）降低，其作用具有剂量依赖性，差异具有显著性（P<0.05），见表3。

    2.3  阿司匹林对A549细胞凋亡的影响 

    2.3.1  形态学观察  阿司匹林5mmol/L、10mmol/L作用A549细胞48h后，HE染色切片上可见典型的细胞凋亡形态学变化，表现为：细胞核固缩，染色质凝集，核碎裂，出现凋亡小体，见图1。表2  奥沙利铂、阿司匹林+奥沙利铂对A549细胞增殖的抑制与对照组相比，*P<0.05,**P<0.012.3.2  TUNEL法检测  阿司匹林5mmol/L、10mmol/L作用A549细胞48h后，TUNEL染色显示核染成棕褐色的凋亡细胞。凋亡指数（AI）分别为17.67%±1.53%和26.33%±2.52%，明显高于对照组3.67%±1.15%，其作用具有剂量依赖性，差异具有显著性（P<0.01）,见图2。

    3  讨论

    我们的实验表明，运用MTT法，阿司匹林确实呈剂量依赖性抑制A549细胞的增殖，作用48小时细胞抑制率最高达65.49%，与Mulshine等 [3]结果相似。

    目前关于COX?2抑制剂抑制肺癌细胞增殖的机制尚未完全清楚，我们通过流式细胞仪检测发现，阿司匹林可呈剂量依赖性影响A549细胞的细胞周期分布，阿司匹林5mmol/L、10mmol/L作用48小时后，G0/G1期细胞比例增高，S、G2/M期细胞比例降低，PI下降到39.8%±2.33%，提示阿司匹林具有明显的 G0/G1期阻滞作用，使进入S期细胞减少，阻碍细胞进入DNA合成期，从而抑制A549细胞增殖。对此，Eli等[4]研究发现，用低剂量吲哚美辛作用于Lewis肺癌细胞后，G1期细胞比例亦增加，而S期、G2/M期细胞比例降低，最终肺癌细胞体外、体内增殖生长受抑。至于COX?2抑制剂影响细胞周期的机制尚不清楚，Goldberg等[5] 发现，苏灵大可抑制HT29细胞表达Cdk2、Cdk4、cyclin以及磷酸化的Rb（PRb），增强p21WAF?1/CIPL的表达，同时降低突变型p53表达水平，引起细胞停滞在G0/G1期，阻止进入S期。Perugini等[6]的研究发现，阿司匹林可通过抑制cyclinD1的表达，引起胰腺癌细胞G0/G1期阻滞，从而抑制细胞增殖。

    另外，我们通过HE和TUNEL染色法检测发现，阿司匹林还具有诱导A549细胞凋亡的作用。阿司匹林5mmol/L、10mmol/L作用48小时后，HE染色见到了典型的细胞凋亡形态学变化，TUNEL染色亦见到较多核染成棕褐色的凋亡细胞，同时凋亡指数（AI）分别上升至17.67%±1.53%和26.33%±2.52%,呈剂量依赖关系。对此，Hida等[7]在研究中亦发现，用尼美舒利作用于NSCLC细胞ACC?LC?91和ACC?LC?323后，30%的ACC?LC?91和12%的ACC?LC?323细胞发生了凋亡。Yao等[8] 发现，用阿司匹林294mg/kg、NS3987mg/kg喂养NNK处理的A/J鼠后，增加了肿瘤细胞凋亡指数（分别从0.07增至0.30和0.33），抑制了肺癌形成（分别达44%和34%）。至于COX?2抑制剂诱导肺癌细胞凋亡机制尚不完全清楚，可能机制如下：a.非酯化花生四烯酸的增加； b.阻止NF?KB活性；c.抑制bcl?2表达；d.激活Caspase?3等。 

    此外，我们的实验还发现，阿司匹林与肺癌化疗的一线药物奥沙利铂(≥6.25μg/mL)联用具有协同或相加抑制A549细胞增殖的作用，该结果与Hida等[9]观察到的COX?2抑制剂JTE?522与紫素或诺维本联用协同抑制肺癌细胞增殖的结果相似。至于COX?2抑制剂能增强一些抗肿瘤药物疗效的机制尚不清楚，Mizutani等[10]曾报道，JTE?522与5?Fu联用膀胱癌时有协同细胞毒作用，其机制可能与抗凋亡分子bcl?XL表达降低，bax/bcl?XL比值升高有关。

    总之，本文研究表明，传统COX?2抑制剂阿司匹林在体外可通过多种机制有效抑制肺腺癌细胞株增殖，同时尚能增强一些抗肿瘤药物的疗效，这有益于开拓阿司匹林应用前景。今后，进一步深入研究其作用机制和体内抗癌的理想剂量，以求提高疗效，减少药物毒副作用，无疑将有重大的临床意义。

【】
  ［1］ Sandler AB,Dubinett SM.COX?2 inhibition and lung cancer[J].Semin Oncol,2004,31(2 Suppl 7):45?52.

[2] Wang W,Qin SK,Chen BA,et al.Experimental study on antitumor effect of arsenic trioxide in combination with cisplatin or doxorubicin on hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2001,7(5):702?705.

[3] Mulshine J,Malkani S,Chung P,et al.Non?small cell lung cancer cycloxygenase activity and proliferation[J].Anticancer Res,1998,18(2A):775?782.

[4] Eli Y,Przedecki F,Levin G,et al.Comparative effects of indomethacin on cell proliferation and progression in tumor cell grown in vitro and vivo[J].Biochem Pharmacol,2001,61(5):565?751.

[5] Goldberg Y,Nassif Ⅱ,Pittas A,et al.The anti?proliferative effect of sulindac and sulindac sulfide on HT?29 conlon cancer cells:alterations in tumor suppressor and cell cycle?regulatory proteins[J].Oncogene,1996,12(4):893?901.

[6] Perugini RA,Protter MW,McDade TP,et al.Sodium salicylate inhibits proliferation and induces G1 cell cycle arrest in human pancreatic cancer cell lines[J].J Gastrointest Surg,2000,4(1):24?32.

[7] Hida T,Kozaki K,Muramatsu H,et al. Cyclooxygenase?2 inhibitor induces apoptosis and enhances cytotoxicity of various anticancer agents in non?small cell lung cancer cell lines[J].Clin Cancer Res,2000,6(5):2006?2011.

[8] Yao R,Rioux N,Castonguay A,et al.Inhibition of COX?2 and induction of apoptosis:two determinants of NSAIDs chemopreventive efficacies in mouse lung tumorigenesis[J].Exp Lung Res,2000,26(8):731?742.

[9] Hida T,Kozaki K,Ito H,et al.Significant growth inhibition of human lung cancer cells both in vitro and in vivo by the combined use of a selective cyclooxygenase?2 inhibitor JTE?522 and conventional anticancer agents[J].Clin Cancer Res,2002,8(7):2443?2447.

[10]Mizutani Y,Kamoi K,Ukimura O,et al. Synergistic cytotoxicity and apoptosis of JTE?522, a selective cyclooxygenase?2 inhibitor, and 5?fluorouracil against bladder cancer[J]. J Urol, 2002, 168(6):2650?2654.