多西紫杉醇诱导人乳腺癌MCF?7细胞凋亡及相关基因表达的影响

             作者：俞乔，高佳希，何晓松， 周晓明，戴美红，俞军

【摘要】  目的 探讨多西紫杉醇(docetaxcel)诱导体外培养人乳腺癌MCF?7细胞凋亡的作用及凋亡的分子机制。方法 通过MTT比色法分析多西紫杉醇对人乳腺癌MCF?7细胞增殖的影响；应用光镜、电镜观察细胞形态学的改变；Annexin?V/PI双染流式细胞术检测肿瘤细胞周期动力学和凋亡诱导率的影响；免疫组化方法检测凋亡相关基因bax、bc1?2的表达变化。结果 多西紫杉醇可明显抑制人乳腺癌MCF?7细胞的增殖，并可导致其形态学的改变；随着加药时间的增长，G2/M期细胞增多，G2/M期细胞和S期细胞的比值也随剂量呈递增关系；加药（IC50）48h后早期凋亡细胞明显增多，同时可上调bax和下调bc1?2的蛋白表达量。结论 多西紫杉醇可明显抑制MCF?7肿瘤细胞的生长，诱导细胞凋亡。其分子机制可能与激活bax和抑制bc1?2等凋亡调控基因有关。

【关键词】  多西紫杉醇；人乳腺癌MCF?7细胞；细胞凋亡；bax；bc1?2

    Key words：Docetaxcel; MCF?7; Apoptosis; bax; bc1?2

    多西紫杉醇(docetaxcel)为有丝分裂抑制剂,该药还有促进细胞凋亡的作用。目前临床上多西紫杉醇作为化疗药物已开始用于乳腺癌、肺癌、胃癌和食管癌等的[1, 2],具有较好效果,且副作用较少。本研究旨在探讨多西紫杉醇对体外培养人乳腺癌MCF?7肿瘤细胞的生长及凋亡作用，以揭示多西紫杉醇的抗癌疗效及作用机制。

    1  材料和方法

    1.1  药物  多西紫杉醇，购自英国?罗纳普朗克乐安公司，含量为20mg/支，0.9%无菌生理盐水配成所需浓度。

    1.2  细胞株  人乳腺癌细胞MCF?7由中科院上海细胞生物学研究所细胞库提供。用含10%的小牛血清（杭州四季青生物工程公司）的1640培养基 (美国GIBCO公司),37℃，5%  CO2 培养箱中培养传代。

    1.3  实验方法

    1.3.1  多西紫杉醇对乳腺癌细胞株MCF?7的增殖作用研究（四甲基偶氮唑盐MTT比色法）  取对数生长期细胞用0.02%  EDTA消化制成2×104/100μl细胞悬液。接种于96孔板，100μl/孔，置37℃，5％  CO2培养箱孵育过夜。给予相应浓度多西紫杉醇，对照组加入相同体积的培养基。ELx800通用型酶标仪（美国BioTek公司）570nm处检测OD值。抑制率如下：

    抑制率%=1-加药组细胞平均吸光值对照组细胞平均吸光值×100%

    1.3.2  多西紫杉醇对MCF?7细胞形态学及超微结构的影响  细胞经0.02% EDTA消化后，制成细胞悬液1×106/ml，贴壁后加多西紫杉醇1.2μM，作用48h后，光镜下观察（×40）。收集细胞，电镜观测。

    1.3.3  多西紫杉醇对MCF?7细胞凋亡率及细胞周期变化的影响  将处于对数生长期的细胞， 调成1×106/ml， 待细胞贴壁后， 加入多西紫杉醇1.2μM， 对照组不加药， 分别于24h、 48h、 72h收集细胞， 用碘化丙啶（PI）进行DNA染色， 用流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）进行DNA含量分析和细胞周期分析， 分析软件为MODFIT和CELLQUEST。

    1.3.4  Annexin?V/PI双染流式细胞术检测多西紫杉醇对MCF?7的诱导凋亡作用  加药24h、 48h后收集细胞， 依Annexin V?FITC Kit（bender公司）操作， 取出195μl细胞悬液加入5μl  Annexin V?FITC混匀并且室温放置10min。 用PBS清洗细胞并重新悬浮于190μl以配好的结合缓冲液中。 加10μl的20μg/ml的PI， 流式细胞仪检测早期细胞凋亡情况。

    1.3.5  免疫组化检测多西紫杉醇对MCF?7细胞bax、 bc1?2基因蛋白表达的影响  将1×106细胞接种于25ml细胞培养瓶中， 待细胞完全贴壁后,加多西紫杉醇1.2μM， 作用48h后， 收集细胞， 涂片， 4℃纯丙酮固定， 然后分别加入抗bax、bc1?2抗体， 室温下孵育60min或4℃过夜； 生物素标记的二抗， 37℃孵育60min， DBA溶液显色后， 苏木素复染， 中性树胶封固， 镜检。 阳性判断： bax、bc1?2基因产物以胞浆和/或胞膜着咖啡色为阳性细胞。

    2  结果

    2.1  多西紫杉醇对MCF?7细胞生长的抑制作用  采用MTT法，研究多西紫杉醇对体外培养人乳腺癌MCF?7细胞的生长抑制作用，绘制其生长抑制曲线，经线性回归得到，药物作用48h，多西紫杉醇对MCF?7细胞的IC50为1.20±0.20μM，表明多西紫杉醇对人乳腺癌细胞株MCF?7有生长抑制作用，并呈现明显的量效关系，见图1。

    2.2  多西紫杉醇对MCF?7细胞形态学及超微结构的影响  光镜研究结果表明，人乳腺癌细胞MCF?7经多西紫杉醇作用48h后，给药组出现明显改变，癌细胞变圆，坏死，生长缓慢。对照组细胞呈上皮性生长迅速，细胞轮廓清楚，见图2。电镜下观察到,对

    图1  多西紫杉醇对MCF?7细胞的抑制作用

    照组：细胞核大,形状不规则,常染色,质丰富,核仁大而明显,见多个核仁。药物作用后,癌细胞核固缩，异染色质增多，核碎裂，胞质中出现大小不一的空泡,裂隙细胞表面微毛消失或变粗，见图3。

    2.3  多西紫杉醇对MCF?7细胞凋亡率及细胞周期变化的影响  实验结果表明MCF?7细胞经多西紫杉醇1.2μM作用24h、48h、72h后，其凋亡率分别为36.06%、72.25%、76.15%，并呈时间依赖性。对照组分别为20.25%、16.54%、25.61%。细胞周期测定显示多西紫杉醇可使MCF?7细胞G2/M期细胞增多，G2/M期细胞和S期细胞的比值也随剂量呈递增关系，见表1。表1  多西紫杉醇（1.2μM）对MCF?7细胞周期的影响

    2.4  Annexin?V/PI双染流式细胞术检测结果  用Annexin?V/PI双染流式细胞术检测可区别活细胞、死亡细胞和早期凋亡细胞，正常细胞FITC及PI拒染(A-/P- ),在流式细胞分析图上为LL区细胞簇。凋亡细胞FITC高染而PI拒染(A+/P- ),图上显示为LR区细胞簇。死亡细胞FITC及PI均高染(A+/P+),图上显示为UR区细胞簇。结果表明，多西紫杉醇作用后，细胞的早期凋亡率为7.83%(24 h), 11.95%(48 h)，21.81%(72 h)，见图4。

    A:未加药组细胞，LL:85.28%，UR:5.97%, LR:5.28%; B: 加阳性对照药5?Fu组细胞（2.5μM)，LL:57.50%，UR:3.54%, LR:38.85%; C：加多西紫杉醇组细胞（1.2μM)，LL:65.08%，UR:6.74%, LR:25%

    图4  Annexin?V/PI双染流式细胞术检测早期凋亡率结果

    2.5  多西紫杉醇对MCF?7细胞bax、bc1?2基因蛋白表达的影响  经多西紫杉醇作用后， bc1?2基因表达蛋白细胞浆和/或胞膜未见着咖啡色，而未加药组可见大部分细胞浆和/或胞膜着咖啡色。经多西紫杉醇作用后，bax基因表达蛋白大部分细胞浆和/或胞膜着咖啡色，而未加药组可见大部分细胞浆和/或胞膜未着咖啡色，见图5。

    3  讨论

    多西紫杉醇具有广泛的抗瘤作用,可多种晚期癌症,如卵巢癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、膀胱癌和食管癌等。近年来许多研究证明,多西紫杉醇可诱导多种肿瘤细胞凋亡[1, 2]。正是由于这种诱导多种细胞凋亡的能力,使多西紫杉醇具有特殊的临床疗效。我们利用乳腺癌细胞株MCF?7为材料,研究多西紫杉醇对细胞凋亡的诱导作用和对乳腺癌细胞周期的影响,并探讨多西紫杉醇诱导乳腺癌细胞凋亡的机制。

    本研究发现其对体外培养人乳腺癌细胞MCF?7有明显的抑制作用， 其IC50 为1.2μM； 多西紫杉醇作用后的MCF?7细胞超微结构与对照组相比有明显变化， 细胞核固缩， 核碎裂， 细胞变圆坏死， 有力的证明多西紫杉醇对MCF?7细胞的杀伤作用。 流式细胞术结果显示细胞凋亡率随时间增加明显提高， 呈时间依赖性。 细胞周期变化显示多西紫杉醇可使得G2/M期细胞增多， G2/M期细胞和S期细胞的比值也随剂量呈递增关系， 有丝分裂受阻， 导致凋亡。Annexin?V/PI双染流式细胞术结果显示细胞早期凋亡率增加。 免疫组化结果表明多西紫杉醇可抑制bc1?2并且增加bax的蛋白表达量。 以上结果表明多西紫杉醇能够抑制肿瘤细胞的生长， 此作用是通过诱导细胞凋亡引起的。 凋亡的分子机制[3]可能是抑制bc1?2及激活bax的表达。 bax和bc1?2都属于bc1?2家族[4]， bc1?2编码蛋白抑制凋亡，  bax编码蛋白促进凋亡， 有报道[5, 6]， bc1?2/bax比例可能是决定细胞对凋亡刺激信号的敏感性的重要因素之一。 当bc1?2过量时， 细胞免遭凋亡， 反之， 细胞易于凋亡。 bax可能诱导细胞色素C的释放，  bc1?2与bax拮抗抑制细胞色素C释放， 阻止其对Caspase蛋白酶的激活， 抑制细胞凋亡。

    多西紫杉醇是一种新型抗肿瘤药物,作用是诱导凋亡。我们对多西紫杉醇处理的乳腺癌细胞MCF?7进行了检测,发现其典型的凋亡特征:电镜观察到细胞核体积缩小,染色质浓缩致密,并沿核膜分布形成新月体状,细胞膜微绒毛消失,细胞浆内线粒体缩小,凋亡小体形成；低Ｇ1峰出现,凋亡的诱导有时间和浓度的依存性。Annexin?V/PI双染流式细胞术结果显示细胞早期凋亡率增加；同时检测的凋亡相关蛋白bc1?2与bax也证明多西紫杉醇可以诱导MCF?7细胞凋亡，除此之外，多西紫杉醇是否还作用于其他基因诱导肿瘤细胞凋亡，如何作用，又是通过何种机制使细胞阻滞于G2/M期，有丝分裂受阻，我们正在做进一步探讨。

【文献】
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