同时产CTX?M?22及TEM?1型β?内酰胺酶的阴沟肠杆菌耐药性分析

【摘要】  目的 了解临床分离阴沟肠杆菌株EC003产β?内酰胺酶的耐药特征和基因型。方法 采用琼脂二倍稀释法对阴沟肠杆菌EC003进行MIC检测，酶提取物三维实验检测AmpC酶，双纸片法筛选及确证实验检测超广谱β?内酰胺酶(ESBLs)，等电聚焦(IEF)电泳测定其等电点。以耐药质粒为模板进行PCR扩增，将β?内酰胺酶全编码基因克隆、表达，并对其扩增产物进行DNA序列测定和同源性分析。结果 阴沟肠杆菌株EC003对所试多数β?内酰胺类抗生素耐药，表型检测AmpC酶为阴性，ESBLs阳性，IEF显示该菌产两种pI分别为8.7及5.4的β?内酰胺酶。PCR扩增产物DNA测序证实为CTX?M?22、TEM?1型β?内酰胺酶全编码基因，产TEM?1的克隆菌株仅对青霉素类耐药，产CTX?M?22的克隆菌株对所试多数β?内酰胺类抗生素耐药，对头孢噻肟的水解程度明显强于头孢他啶。结论 临床分离阴沟肠杆菌株EC003同时产CTX?M?22和TEM?1型两种β?内酰胺酶，可导致对多数β?内酰胺类抗生素耐药。

【关键词】  阴沟肠杆菌 耐药性 β?内酰胺酶 表型 基因型

    Characterization of a clinical isolate of Enterobacter cloacae

     ABSTRACT  Objective  To analyze the phenotype and genotype of extened?spectrum β?lactamases (ESBLs) produced by E.cloacae clinical isolate EC003.  Methods  E.cloacae EC003 was identified using the API20?E system and detected by three?dimensional extract test for AmpC β?lactamases and confirmatory test for ESBLs; antimicrobial susceptibility was determined with the standard agar dilution; isoelectric points (pIs) of β?lactamases were determined by isoelectric focusing (IEF); plasmid was extracted and genome DNA was sequenced by PCR amplification; the PCR products were cloned into pBK?CMV vector and the antimicrobial susceptibility of the clone strains were tested; the nucleotide and deduced protein sequences were also analyzed with the BLAST software of NCBI.  Results  E.cloacae EC003 produced two kinds of β?lactamases with pI value of 8.7 and 5.4 respectively; A 7kb plasmid was isolated from EC003, two gene fragments were obtained by PCR using the plasmid as template. The nucleotides and deduced protein sequences were identified as CTX?M?22 and TEM?1 type β?lactamases. The clone strain producing TEM?1 was resistant to ampicillin and piperacillin only, while the CTX?M?22 clone strain was resistant to most of β?lactams and much more active to hydrolysis cefotaxime than to ceftazidine.  Conclusions  The cause of the E.cloacae EC003 to develop resistance to most of β?lactams might be due to the simultaneous production of CTX?M?22 and TEM?1 type β?lactamases.收稿日期：2006?06?30

     阴沟肠杆菌是引起呼吸道和泌尿生殖道感染的常见病原菌，产生AmpC酶是其对β?内酰胺类抗生素耐药的重要机制。但近年来研究报道证实了产生超广谱β?内酰胺酶(ESBLs)是造成阴沟肠杆菌对第三代头孢菌素耐药的另一重要原因，特别是产生多种β?内酰胺酶所致的耐药问题越来越受到人们的关注［1，2］。我们在研究川北医学院附属临床分离产ESBLs菌株的基因型时，发现阴沟肠杆菌EC003同时含有两种β?内酰胺酶，并分属其两大家族。现将研究结果报道如下。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  菌株来源  阴沟肠杆菌株EC003系川北医学院附属医院检验科分离，经法国Bio?Merieux公司API20?E系列鉴定菌种。E.coli JM109［F′traD36 proA+ proB+ lacIq lacZ△M15/recA1 endA1 gyrA96 (Nalr) thi hsdR17 supE44 relA1 △(lac?proAB) mcrA］由四川大学华西基础医学与法医学院感染免疫研究室惠赠，标准质控大肠埃希菌ATCC25922，标准质控肺炎克雷伯菌700603(产ESBL)由四川抗菌素研究所惠赠，TEM?1(pI5.4)和SHV?1(pI7.6)标准产酶菌由加拿大Queen′s大学医学院惠赠。

    1.1.2  主要试剂  头孢噻吩(cephalothin，CET)为吉林辉南长龙药业生产；氨苄西林(ampicillin，ABPC)和哌拉西林(piperacillin，PIPC)购自Roche公司；舒巴坦(sulbactam，SB)为吉林辉南长龙药业生产；头孢哌酮(cefoperazone，CPZ)、头孢噻肟(cefotaxime，CTX)、头孢唑林(cefazolin，CEZ)、头孢呋辛(cefuroxime，CXM)、和头孢他啶(ceftazidime，CAZ)由哈药集团制药总厂生产。三唑巴坦(tazobactam，TB)为哈尔滨誉衡药业产品；亚胺培南(imipenem，IMP)购自Merck Sharp & Dohme(上海)公司；头孢吡肟(cefepime，CPE)和氨曲南(aztreonam，AZ)为Bristol?Myers Squibb(上海)公司产品；头孢他啶纸片、头孢噻肟纸片、头孢他啶/克拉维酸纸片、头孢噻肟/克拉维酸纸片、头孢西丁纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；pI标准(pI4.45～9.6)和Biolyte(pH3～10)购自Bio?RAD公司；丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品；Taq酶、dNTP、RNase购自Gibco公司；DNA柱式胶回收试剂盒购自上海生工生物公司。

    1.1.3  主要仪器设备  Universal 16R型台式高速冷冻离心机(Tuttlingen)，PTC?150型PCR仪(MJ Research公司，美国)，GDS?2000多功能凝胶成像和分析系统(美国)。

    1.2  方法

    1.2.1  药物敏感实验  采用常规琼脂二倍稀释法，SB和TB的浓度固定为5mg/L。操作及结果判读按CLSI/NCCLS文件M100?S11(2001年版)进行。

    1.2.2  AmpC酶及ESBL表型鉴定  采用KB(Kirby?Bauer)法，用头孢西丁纸片检测受试菌株，抑菌圈≤17mm疑为产AmpC酶，确证实验按Coudron报道的三维实验方法［3］；用头孢他啶纸片、头孢噻肟纸片、头孢他啶/克拉维酸纸片、头孢噻肟/克拉维酸纸片进行ESBL表型鉴定筛选及确认，结果按CLSI/NCCLS文件M100?S11(2001年版)推荐标准判读。

    1.2.3  β?内酰胺酶等电聚焦(IEF)实验  超声破壁法制备β?内酰胺酶粗提取液，pI判读采用浸有0.05% nitrocefin的滤纸染色，以标准产酶株作参照，并结合BioRad的等电点标准品考马斯亮蓝R250染色进行。具体操作依照文献［4］进行。

    1.2.4  细菌质粒DNA提取与PCR扩增  碱裂解法提取耐药质粒。编码框以外设计blaCTX?M?1组(P1：5′?CTGCGGATCCCATGGTTAAAAAATCA?3′，P2：5′?CTGCGAATTCTTACAAACCGTTGGTG?3′)及blaTEM(P3：5′?CTGCGGATCCCATGAGTATTCAA?CATTTC?3′，P4：5′?CTGCGAATTCTTACCAATG?CTTAATCAGT?3′)通用引物，所有引物5′分别引入EcoRI或BamHI酶切位点，由上海申能博彩公司合成。以EC003质粒DNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增条件为，先94℃预变性3min，然后进入循环，循环参数为：94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1min，共30个循环，末次循环自动延伸7min。取5μl扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

    1.2.5  PCR产物的纯化、克隆  按照PCR产物纯化试剂盒(QIAgen)的要求，分别纯化目的基因片段，经EcoRI和BamHI酶切与经EcoRI和BamHI酶切后的pBK?CMV(含有卡那霉素抗性基因)连接。连接反应液转化至E.coli JM109感受态细胞，经含氨苄西林(50mg/L)/卡那霉素(50mg/L)的麦康凯培养基筛选。挑取白色菌落，接种于含氨苄西林的LB培养液中，37℃培养过夜。用碱裂解法提取克隆菌株中的质粒，经EcoRI和BamHI酶切鉴定，并测定克隆菌株对于多种β?内酰胺类抗生素的敏感性，提取克隆菌株产生的β?内酰胺酶并测定其对多种β?内酰胺类抗生素相对水解率［5］。

    1.2.6  核苷酸序列测定及分析  PCR产物纯化后送上海基康生物公司测序，测序结果采用国际互联网上NCBI的BLAST工具进行同源性检索分析。

    2  结果

    2.1  14种抗生素的抗菌活性

    从Tab.1可见，阴沟肠杆菌株EC003和CTX?M?22克隆菌株对所试多数β?内酰胺类抗生素耐药，产TEM?1克隆菌株主要对青霉素类耐药，但均对CPZ/TB(SB)复方制剂敏感。

     2.2  AmpC酶及ESBL表型鉴定结果

    头孢西丁纸片抑菌圈>17mm,三维实验检测AmpC酶亦为阴性。头孢他啶、头孢噻肟联合使用克拉维酸的抑菌环直径比单药纸片的抑菌环直径>6mm，证明阴沟肠杆菌EC003为产ESBL菌株。

    2.3  IEF结果和β?内酰胺酶的初步分型 

    阴沟肠杆菌EC003产生两种pI分别为5.4和8.7的β?内酰胺酶，结合已发现ESBLs的pIs资料(http://www.lahey.org/Studies/other.asp)和耐药表型，可以初步推测此两种酶为TEM和CTX?M型β?内酰胺酶。

    2.4  TEM和CTX?M?1组酶全编码基因扩增、克隆及表达

    从阴沟肠杆菌EC003菌株中提取到大小约为7kb的质粒，以该质粒DNA为模板进行PCR扩增，两种酶全编码基因扩增的阳性片段大小均约为900bp，克隆菌株的重组质粒经EcoRI和BamHI酶切后产生的片段大小亦约为900bp，与PCR产物大小一致(Fig.1)。blaCTX?M?22、blaTEM?1克隆菌株对多种β?内酰胺类抗生素的敏感性及所产β?内酰胺酶对多种β?内酰胺类抗生素的相对水解率见Tab.1和Tab.2。

    2.5  基因序列分析

    将上述扩增产物纯化后进行DNA序列测定，测序结果在国际互联网上进行BLAST检索分析，与GenBank中CTX?M?22(AY080894)，TEM?1(AY302260)编码基因序列的同源性分别为100%和99%。本次检出的blaTEM?1发生了两个碱基突变，即第228位(C?T)和第396位(G?T)，但根据基因序列推导的氨基酸序列与TEM?1(AY302260)相比较并没有差异。

    3  讨论

    1983年德国首次报道产ESBLs临床分离菌株［6］，以后短短20余年间，世界上许多国家都相继大量报道，其中以TEM型和SHV型较为多见。但自从20世纪90年代以来，CTX?M型ESBLs的报道不断增多，这类酶与TEM、SHV型ESBLs的同源性低，而与产酸克雷伯菌染色体介导的β?内酰胺酶有较高的同源性。不同家族的ESBLs其酶活性、水解底物轮廓、流行分布等特征存在着较大的差异，即使是同一家族中的不同亚型，酶分子的特性也各不相同。因此深入研究ESBLs基因及其编码产物，对于阐明细菌对第三代头孢菌素耐药的分子机制非常重要。

    本试验观察到，阴沟肠杆菌株EC003同时产TEM?1和CTX?M?22两种类型的β?内酰胺酶，它们的编码基因均位于一大小约7kb的质粒上。药敏试验显示阴沟肠杆菌EC003对β?内酰胺类抗生素的耐药程度明显高于克隆菌株，可能是同时产CTX?M?22和TEM?1型两种β?内酰胺酶导致其耐药水平高、耐药谱扩大，即β?内酰胺酶产量过多及对β?内酰胺类抗生素的非水解“牵制”作用的结果［7］。产TEM?1克隆菌株主要对青霉素类耐药，产CTX?M?22克隆菌株对包括第三代头孢菌素在内的多数β?内酰胺类抗生素物均呈现耐药，但对亚胺培南以及对β?内酰胺类/β?内酰胺酶抑制剂复方敏感。CTX?M?22对多数的β?内酰胺类抗生素具有明显水解作用，其对头孢噻肟水解能力是头孢他啶的12倍，但头孢吡肟、亚胺培南对之十分稳定。β?内酰胺酶抑制剂(TB，SB)对TEM?1，CTX?M?22的活性具有明显抑制作用。资料显示［8］，240位的Lys或Arg活性基团是TEM、SHV型ESBLs最常见的活性基团，且与水解头孢他啶密切相关，由于CTX?M?22缺少此类活性基团(CTX?M?22为Asp?240)，因而可能导致头孢他啶对CTX?M?22菌株的抗菌作用强于头孢噻肟。根据NCCLS的推荐意见，所有产ESBLs菌株均应视为对所有青霉素类、头孢菌素类(包括第三、四代头孢菌素)和氨曲南耐药。单纯产TEM?1菌株所致的感染仍可使用第三代头孢菌素、氨曲南等进行抗菌，但对于同时产生ESBLs的重症感染患者宜选用碳青霉烯类药物。

【】
  ［1］ Bell J M, Turnidge J D, Jones R N, et al. Prevalence of extended?spectrum beta?lactamase?producing Enterobacter cloacae in the Asia?Pacific region: results from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, 1998 to 2001 ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2003,47(12):3989

［2］ Thomson K S. Controversies about extended?spectrum and AmpC beta?lactamases ［J］. Emerg Infect Dis,2001,7(2):333

［3］ Coudron P E, Moland E S, Thomoson K S. Occurrence and detection of AmpC beta?lactamases among Escheri?chia coli, Klebsiella pneumoniae, and Proteus mirabilis isolates at a veterans medical center ［J］. J Clin Micro?biol,2000,38(5):1791

［4］ 凌保东，王浴生，李显志. Ceftazidime耐药细菌的β?内酰胺酶研究［J］. 抗生素杂志，1990，15(8)：188

［5］ 张翔，凌保东，雷军，等. 细菌β?内酰胺酶对4种头孢菌素的水解作用及三唑巴坦的抑酶效应研究［J］. 中国抗生素杂志，2004，29(11)：665

［6］ K1ieb C, Nies B, Meyer J F, et al. Evolution of plasmid?encoded resistance to broad?spectrum cephalosporins ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1985,28(2):302

［7］ Gutmann L, Williamson R. A model system to demonstrate that beta?lactamase?associated antibiotic trapping could be a potential means of resistance ［J］. J Infect Dis,1983,148(2):316