RP?HPLC法测定泛昔洛韦分散片的含量及有关物质

【摘要】  目的 建立高效液相色谱法分离测定泛昔洛韦分散片的含量及有关物质的方法。方法 采用Kromasil C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；流动相：乙腈∶0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(25∶75)；流速：1.0ml/min；有关物质测定检测波长为220nm，含量测定检测波长为305nm；进样量20μl。结果 泛昔洛韦浓度在29.40～88.20μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.99998；平均回收率为100.1%，RSD为0.30%，n=9；泛昔洛韦与有关物质能完全分离。结论 本方法简便、准确、专属性强，可用于泛昔洛韦分散片的含量及有关物质的测定。

【关键词】  福建省药品检验所， 福州350001

    Determination of famciclovir and its related substances in

      ABSTRACT  Objective  To develop an RP?HPLC method for the determination of famciclovir and its related substances in famciclovir dispersible tablets.  Methods  The chromatographic analysis was performed on Kromasil C18 (4.6 mm×250 mm, 5μm) column. The mobile phase consisted of acetonitrile∶0.02mol/L phosphate buffer (25∶75). The flow rate was 1.0 ml/min. The detection wavelength was at 305nm for the content determination of famciclovir and it was 220nm for the analysis of its related substances, with 20 μl injection volume.  Results  A good linearity was obtained in the range of 29.40～88.20μg/ml (r=0.99998). The average recovery of famciclovir was 100.1% (n=9) with RSD 0.30%. The related substances were separated from famciclovir.  Conclusion  The method was simple, accurate and specific, and could be used for the quality control of famciclovir dispersible tablets.

    KEY WORDS  RP?HPLC;  Famciclovir dispersible tablets;  Content determination;  Related substances

     泛昔洛韦是一种开环核苷类新型高效、低毒抗病毒药物。本品口服吸收快，体内在酶促条件下，经脱酯和嘌呤环的氧化作用迅速转化为喷昔洛韦而发挥药效。它对单纯疱疹I型和II型(HSV?1，HSV?2)、水痘、带状疱疹病毒(VZV)均有抗病毒活性［1］，也可用于阿昔洛韦无效或不敏感的严重疱疹病毒感染和乙型肝炎［2］。泛昔洛韦分散片为该药的新剂型，它崩解快，起效迅速，效果明显。本文用反相高效液相色谱法测定泛昔洛韦分散片的含量及有关物质，专属性强，准确简便，结果满意。

    1  仪器与试药

    HP1100型高效液相色谱仪(G1311A四元泵，G1379A脱气机，G1316A柱温箱，G1313A自动进样器，G1314A紫外检测器)、Ver0801 chemistation色谱工作站(Agilent公司)。Cary100分光光度计(VARIAN公司)。

    泛昔洛韦对照品，含量98.9%；泛昔洛韦分散片，批号05010001、 05010003、05010005(厦门建发制药有限公司提供)；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

    2  方法与结果

    2.1  色谱条件与系统适用性试验

    色谱柱：Kromasil C18(4.6mm×250mm，5μm)(大连依利特仪器有限公司)，Varian C18(4.6mm×250mm，5μm)(美国Varian公司)；流动相：乙腈∶0.02mol/L磷酸二氢钾溶液(25∶75)；流速1.0ml/min；有关物质测定检测波长为220nm，含量测定检测波长为305nm；进样量20μl。在有关物质测定的色谱图中，理论板数按泛昔洛韦峰计为14369，泛昔洛韦主峰与相邻的峰的分离度大于3。

    2.2  检测波长的选择

    精密称取泛昔洛韦对照品和样品细粉，用流动相溶解并制成每1ml含泛昔洛韦10μg的溶液，分别在400～200nm波长范围内扫描，结果泛昔洛韦对照品及样品在220、242与305nm波长处有最大吸收。确定220nm为有关物质测定的波长，305nm为含量测定波长。

    2.3  有关物质测定

    2.3.1  测定方法  取本品细粉适量，加流动相溶解，稀释，分别制成每1ml含泛昔洛韦0.1mg的供试品溶液和每1ml含1.0μg的对照溶液。照上述色谱条件并在检测波长220nm处进行试验。取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的25%；再精密量取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。如显杂质峰，与对照溶液比较，杂质含量。

    2.3.2  专属性试验

    (1)样品有关物质  取样品按上述测定方法测定，3批样品有关物质分别为0.76%、0.82%和0.85%，杂质峰与泛昔洛韦主峰均能分离(Fig.1A)。

    (2)酸破坏试验  称取本品细粉38.80mg，加0.1mol/L盐酸溶液5ml，放置1h，中和后依法稀释并测定，记录的色谱图显示泛昔洛韦主峰面积减小，杂质峰面积明显增大，杂质峰总面积为原来未破坏样品杂质峰总面积的9倍多，但各个峰之间均能较好地分离(Fig.1B)。

    (3)碱破坏试验  取本品细粉38.55mg，加入0.05mol/L氢氧化钠溶液1ml，放置30min，中和后依法稀释并测定，色谱图显示泛昔洛韦主峰面积减小，出现三个峰面积较大的新的杂质峰，原杂质峰面积明显增大，杂质峰总面积约为原来未破坏样品杂质峰面积的48倍。说明本品在碱中很容易破坏，在碱性下破坏后主成分被部分降解，并产生一些其它的杂质(Fig.1C)。

    (4)高温破坏试验  取本品细粉置90℃加热6h，放冷，称取37.52mg，同法测定，色谱图中泛昔洛韦主峰面积减少，出现了一些新的小杂质峰，杂质峰总面积约为原来杂质峰面积的2倍。说明高温对泛昔洛韦稍有影响。

    (5)高湿试验  取本品，依［3］进行吸湿性试验，结果显示本品吸湿性强。称取适量，同法溶解并稀释，进样测定，色谱图中泛昔洛韦主峰面积减小并产生一个面积很大的新杂质峰，且原杂质峰面积明显增大。说明湿度对泛昔洛韦影响大(Fig.1D)。

    (6)氧化破坏试验  称取样品37.47mg，进行氧化破坏试验后，取适量加流动相使溶解并稀释，同法测定，图中显示，主峰面积减小，出现三个新杂质峰，原杂质峰面积明显增大(Fig.1E)。

    (7)光照试验  取本品细粉适量，依文献［4］进行光照试验并测定，结果显示主峰面积减少很多，产生一个面积很大的新杂质峰，且原杂质峰面积明显增大，说明长时间光照对泛昔洛韦影响很大(Fig.1F)。

    综上所述，酸、碱、高温、高湿、氧化、光照等破坏对泛昔洛韦分散片影响大，且均有降解产物产生，产生的杂质大多能分离。另按处方配制除泛昔洛韦以外的其他成分和辅料制成阴性溶液，按上述选定的方法进行测定，色谱图显示阴性溶液在泛昔洛韦的主峰位置没有出现其他的杂质峰，说明此方法可避免其他成分和辅料的干扰。

    2.3.3  检测限和定量限  精密称取泛昔洛韦对照品适量，用流动相适量使溶解后，进一步稀释成不同浓度的两份，一份用流动相稀释成最终浓度含泛昔洛韦为2.5ng/ml、另一份稀释成最终浓度含泛昔洛韦为7.5ng/ml的系列溶液，分别取该两系列溶液按上述色谱条件测定，记录色谱图，并对色谱系统进行基线检测，结果泛昔洛韦检测限浓度为2.5ng/ml(S/N=3)，定量限浓度为7.5ng/ml(S/N=10)。

    2.3.4  重复性试验  精密称取同一批样品细粉适量(约相当于泛昔洛韦125mg)，称取6份，按“2.3.1”项下的方法配制溶液并按选定的色谱条件测定，以泛昔洛韦的杂质的百分含量计算，RSD为0.54%(n=6)，表明重复性良好。

    2.3.5  稳定性试验  取同一份样品溶液，按上述测定方法测定，每2h测定1次，连测5次，以杂质的百分含量，RSD为1.91%，说明稳定性良好。

    2.3.6  耐用性试验  分别用Varian C18(4.6mm×250mm， 5μm)和Kromasil C18(4.6mm×150mm，                      A: Sample without treatment;  B: Destroyed by acid;  C: Destroyed by alkali;

    D: 10d in heavy moisture;  E: Destroyed by oxidization;  F: 10d with illumination

    Fig.1    HPLC chromatograms of related substances test for famciclovir dispersible tablets

    5μm)两种色谱柱对泛昔洛韦分散片中有关物质进行测定，记录的色谱图峰形均良好，理论板数按泛昔洛韦峰计均为10000以上，泛昔洛韦峰与相邻的峰的分离度均在1.5以上，耐用性好。

    2.4  含量测定

    2.4.1  溶液的制备  取泛昔洛韦分散片20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于泛昔洛韦125mg)，置250ml量瓶中，加流动相溶解，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液；精密称取泛昔洛韦对照品，用流动相溶解并稀释成每1ml约含泛昔洛韦50μg的溶液，作为对照品溶液。

    2.4.2  含量测定方法  精密量取上述配制好的样品溶液20μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图，另取泛昔洛韦对照品溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算，色谱图见Fig.2。

    2.4.3  专属性试验  取“2.4.1”项下配制好的对照品溶液和样品溶液，并按处方配制除泛昔洛韦以外的其他成分和辅料制成阴性溶液，按上述选定的方法进行测定，色谱图显示样品溶液出现的主峰与对照品主峰的保留时间一致(Fig.2)，阴性溶液在泛昔洛韦的主峰位置没有出现其他的杂质峰，说明其他成分和辅料不干扰泛昔洛韦的含量测定。

    2.4.4  线性关系  精密称取泛昔洛韦对照品37.16mg置250ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，分别量取10.0、15.0、20.0、25.0和30.0ml各置50ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件分别精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品浓度C(μg/ml)为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归(Fig.3)，回归方程为：

    A=25.017C+0.4402  r=0.99998

    表明泛昔洛韦浓度在29.40～88.20μg/ml范围内与A: Reference;  B: Sample

    Fig.2    HPLC chromatograms of famciclovir

    dispersible tablets

    Fig.3    Linear relationship of the sample concentration

    and peak area

    峰面积呈良好的线性关系。

    2.4.5  精密度试验  取同一份对照品溶液，按上述选定的色谱条件测定，连续进样6次，记录色谱图，以峰面积计算，RSD为0.14%，说明精密度良好。

    2.4.6  重复性试验  精密称取样品细粉适量(约相当于泛昔洛韦125mg)，称取6份，按“2.4.1”项下的方法配制溶液并按选定的色谱条件测定，以泛昔洛韦的含量计算，RSD为0.20%(n=6)，表明重复性良好。

    2.4.7  稳定性试验  取“样品含量测定”项下的同一份样品溶液，按上述选定的方法测定，于0、2、8、10和24h测定，以泛昔洛韦的百分含量计算，RSD为0.22%，说明配制好的样品溶液24h内稳定。

    2.4.8  回收率试验

    按处方配制三种不同浓度的溶液各3份，共9份，按上述选定的方法测定，计算回收率。结果见Tab.1。

    2.4.9  样品的含量测定  取批号为05010001、05010002、05010003的3批样品，按“2.4.1”项下方法配制样品溶液和对照品溶液，各精密量取20μl注入液相色谱仪，按上述选定的色谱条件测定，按外标法以峰

    3  讨论

    (1)本文中的含量测定方法采用305nm为检测波长，避免可能产生的杂质的干扰；而采用220nm波长测定其有关物质，在此波长下更灵敏，可有效测定已产生的杂质。

    (2)试验表明，本文介绍的HPLC色谱条件，对泛昔洛韦及其相关物质相互间均有良好分离度，互不干扰检测。

    (3)泛昔洛韦为碱性药物，实验中选择磷酸二氢钾溶液作为流动相的水相，有利于泛昔洛韦的出峰。选择磷酸二氢钾溶液浓度为0.02mol/L，峰形对称，柱效高，基线平稳。

    (4)泛昔洛韦分散片作为需快速崩解分散的药物剂型，所用辅料与普通片剂不同，辅料多达九种，但在本方法色谱条件下，辅料不出峰，不干扰泛昔洛韦的含量和有关物质的测定。

    (5)在酸、碱、氧化破坏试验中表明，本品易受这些条件的影响，光照与湿度也易影响本品的质量，故应注意本品的储藏条件和使用的期限。

    (6)实验结果表明，本方法能较好地测定泛昔洛韦分散片的含量及有关物质，专属性强，灵敏度高，结果准确。

【】
  ［1］ Li K X, Zhang J J, Hu X, et al. Study on bioequivalence of famciclovir capsules in human ［J］. China Pharm J(药学杂志),2000,35(7):463

［2］ Zhang Y P. Virmax ［J］. Chin J New Drugs(中国新药杂志),1999,8(2):119

［3］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(二部)［S］. 北京：化学出版社，2005：附录XIXB

［4］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(二部)［S］. 北京：化学工业出版社，2005：附录XIXC