CpG?N ODN对CpG?S ODN诱导hPBMC释放TNF?α的抑制作用

             作者：蒋为薇 王良喜 丁国富 余双江

【摘要】  目的 明确抑制性CpG ODN 208(CpG?N ODN)对刺激性CpG ODN 1826(CpG?S ODN)诱导单核/巨噬细胞分泌TNF?α的影响，为通过拮抗细菌DNA达到防治脓毒症的目的提供实验依据。方法 选用本室前期筛选出的对CpG?S ODN活化RAW 264.7细胞有抑制作用的CpG?N ODN，观察其对CpG?S ODN诱导hPBMC释放TNF?α的影响；应用流式细胞术观察CpG?N ODN对CpG?S ODN与hPBMC表面结合和内化的影响。结果 浓度比为1∶1的CpG?N ODN对刺激性CpG?S ODN诱导hPBMC分泌TNF?α具有抑制作用，并呈一定时效关系；CpG?N ODN对CpG?S ODN在hPBMC细胞表面的结合和内化具有抑制作用。结论 CpG?N ODN对CpG?S ODN活化hPBMC具有抑制作用，这个作用可能与其影响hPBMC的表面结合和内化CpG?S ODN有关。

【关键词】  脓毒症 抑制性CpG ODN 刺激性CpG ODN TNF?α 表面结合 内化

    ABSTRACT  Objective  To study the influence of CpG ODN 208 (CpG?N ODN) on TNF?α release from hPBMC induced by CpG?S ODN 1826 (CpG?S ODN).  Methods  CpG?N ODN, selected by the previous work in our lab, can inhibit TNF?α release from RAW264.7 induced by CpG?S ODN. The influence of CpG?N ODN on TNF?α release from hPBMC induced by CpG?S ODN was measured by ELISA. The effects of CpG?N ODN on the surface binding and internalization of CpG?S ODN were tested by flow cytometry.  Results   CpG?N ODN could inhibit TNF?α release from hPBMC induced by CpG?S ODN at the concentration ratio 1∶1 in a time?dependent manner. CpG?N ODN could inhibit the surface binding and internalization of CpG?S ODN. Conclusion  CpG?N ODN could inhibit TNF?α release from hPBMC induced by CpG?S ODN, which partly attributed to inhibition of CpG?N ODN on the surface binding and internalization of CpG?S ODN.

    KEY WORDS  Sepsis;  CpG?N ODN;  CpG?S ODN;  TNF?α;  Surface binding;  Internalization

    脓毒症(sepsis)是一种严重创伤和感染的引起全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，由其来的多器官功能不全综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)病死率高达30%～50%，但目前尚无有效的防治措施［1］。细菌基因组DNA(细菌DNA)是SIRS的主要启动因子之一。未甲基化CpG的寡核苷酸片段(CpG oligonucleotides，CpG ODN)是细菌DNA的免疫刺激作用的最小作用单位，广泛存在于细菌DNA中［2］。细菌DNA之所以被哺乳动物视作异己成分而启动防御反应，是因为其有着与不如DNA明显不同的结构特征：细菌DNA中的CpG二核苷酸出现的频率约为1/16，而哺乳动物DNA中的CpG二核苷酸出现的频率仅为1/64，并且80%发生甲基化［3］。研究者们发现只有含有未甲基化CpG为核心的特定六核苷酸序列的CpGODN才具有刺激性， 这些特定的六核苷酸被称为刺激性CpG基序(stimulatory CpG motif，CpG?S ODN)［3］。Krieg等通过对Adv2 DNA、Adv5 DNA、Adv12 DNA和大肠埃希菌DNA发现部分CpG ODN对细胞的刺激活性较弱，并能对CpG?S ODN活化细胞有抑制作用，因此推断这些序列可能是中和性CpG基序(neutralizing CpG motif；CpG?N ODN)［4］。由于上述研究中发现的CpG?N ODN活性并不稳定，因此在Krieg的研究基础上，我们进一步寻找并得到有效的CpG?N ODN：CpG ODN 208(5′?TGCCGCGGC?AGA?3′)，CpG ODN 208对RAW264.7细胞的刺激活性较弱，并对CpG?S ODN活化的细胞具有抑制作用。因此，本研究以CpG?N ODN和CpG?S ODN共同诱导人外周血单个核细胞(human peripheral blood mononuclear cells，hPBMC)，观察CpG?N ODN对CpG?S ODN诱导hPBMC分泌TNF?α的影响，进一步探讨其可能的作用机制。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    全硫代修饰的CpG ODN 208(CpG?N ODN)：5′?TGCCGCGGCAGA?3′，由大连宝生物公司合成；全硫代修饰的CpG ODN 1826(CpG?S ODN)：5′?TCCCTGACGTTCCTGACGTT?3′和6?FAM标记的CpG ODN 1826由上海博亚生物技术有限公司合成。淋巴细胞分离液购自挪威Axis?Shield公司，比重1.077。RPMI 1640培养液购自Hyclone公司，胎牛血清购自PAA公司。人TNF?α检测试剂盒购自Bioscience公司。实验用移液管，吸管，离心管等玻璃器材均经260℃高温3h去热原处理；培养板购自BD公司，无热原，一次性使用。

    1.2  hPBMC的分离

    按淋巴细胞分离液说明书进行，密度梯度离心法。无菌静脉穿刺采血，肝素抗凝。在8ml离心管中加3m1淋巴细胞分离液，取5m1抗凝血加到分离液液面上，2000r/min离心15min。小心吸取中间白膜层，转到新的离心管内，用冷生理盐水洗涤2次，1500r/min离心6min弃上清，加2m1 RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素)，吹匀制成细胞悬液备用。

    1.3  CpG?N ODN抑制CpG?S ODN诱导hPBMC分泌细胞因子的作用

    调整hPBMC悬液浓度为1×106/ml，取0.2ml细胞悬液加于96孔板内，置37℃ CO2温箱培养2h，同时加入0、10、20、30、40、50μg/ml CpG?N ODN和10μg/ml的CpG?S ODN，每组设3复孔，另设阳性对照组加入100ng/ml LPS，置37℃继续培养8h，取100μl上清，所有上清立即进行ELISA检测TNF?α。

    1.4  CpG?N ODN抑制CpG?S ODN诱导hPBMC分泌细胞因子的时效关系

    按上述方法将hPBMC加于96孔板后，置37℃ CO2温箱培养2h，CpG?N ODN相对于CpG?S ODN的时相点分别为-2、-1、0、1和2h，CpG?N ODN和CpG?S ODN均为10μg/ml，每组3复孔，另设阳性对照组，0时相点加入100ng/ml LPS。置37℃继续培养8h后取100μl上清测定TNF?α。

    1.5  CpG?N ODN与CpG?S ODN预孵对hPBMC分泌细胞因子的影响实验

    按上述方法将hPBMC加于96孔板后，置37℃ CO2温箱培养2h，将一组CpG?N ODN和CpG?S ODN各10μg/ml预孵2h，另一组的CpG?N ODN和CpG?S ODN不预孵，直接加入hPBMC中，每组3复孔。置37℃继续培养8h后取100μl上清测定TNF?α。

    1.6  CpG?N ODN对hPBMC表面结合CpG?S ODN的影响

    调整hPBMC悬液浓度为1×106/ml，按每孔0.5ml加入24孔板内，同时加入10μg/ml的CpG?N ODN和5′6?FAM?CpG?S ODN；另设阳性对照：加入10μg/ml的5′6?FAM?CpG?S ODN；阴性对照：未加任何处理。4℃避光继续培养30min后取出，采用流式技术检测。

    1.7  CpG?N ODN对hPBMC内化CpG?S ODN的影响

    调整hPBMC悬液浓度为1×106/ml，按每孔0.5ml加入24孔板内，同时加入10μg/ml的CpG?N ODN和56?FAM?CpG?S ODN；另设阳性对照：加入10μg/ml的5′6?FAM?CpG?S ODN；阴性对照：未加任何处理。37℃避光继续培养2h后取出，采用流式技术检测。

    1.8  统计学处理

    所得数据均以±s表示，应用Microsoft Excel进行统计分析处理，P<0.05为有显著性差异。

    2  结果

    2.1  CpG?N ODN抑制CpG?S ODN诱导hPBMC分泌TNF?α的作用

    加人不同浓度(10～50μg/ml)CpG?N ODN后，当CpG?N ODN与CpG?S ODN浓度比为1∶1时，hPBMC释放细胞因子的作用受到抑制(P<0.05)；而其它比例剂量时未见抑制作用，但也无协同或相加作用。因此我们在1∶1的浓度比条件下研究其量效关系：提前和与CpG?S ODN同时给CpG?N ODN均可抑制hPBMC分泌细胞因子(P<0.05)，且抑制效果相当，约为25%；延后给则未见抑制效应(Fig.1)。

    2.2  CpG?N ODN与CpG?S ODN不直接结合和相互作用

    为观察CpG?N ODN对CpG?S ODN的抑制作用是否因为其直接作用引起，将CpG?N ODN与CpG?S ODN进行预孵，如果是直接相互作用引起，则预孵组的抑制细胞因子释放的效果可能更好。结果显示，CpG?S ODN预孵与否对hPBMC释放TNF?α没有影响，说明预孵CpG?N ODN和CpG?S ODN对CpG?N ODN的抑制作用没有影响，CpG?N ODN与CpG?S ODN并非直接结合和相互作用(Fig.2)。

    2.3  CpG?N ODN抑制CpG?S ODN在hPBMC表面结合和内化 CpG ODN与细菌表面接触后被细胞吞噬、内化进入，形成早期内体。早期内体与溶酶体融合形成晚期

    3  讨论

    Krieg等［4］有关腺病毒DNA的研究提示，A亚属的血清型12腺病毒(Adv12)和C亚属的血清型2、5腺病毒(Adv2、Adv5)，其DNA都含有与大肠埃希菌DNA(EC DNA)相似频率的未甲基化CpG二核苷酸，且均含有较多的CpG?S基序，但却有截然不同的免疫活性：其中Adv12有着与EC DNA相似的刺激性，而Adv2和Adv5 DNA不但无刺激性，还能够拮抗Adv12和EC DNA的刺激作用，在浓度比为1∶1的时候，抑制率可达90%以上。这就提示Adv2和Adv5中可能存在一些活性片段，既能抑制Adv2和Adv5自身所含的CpG?S基序，也能抑制Adv12和EC DNA所含的CpG?S基序。

    Krieg等［4］首先报道了抑制性或中和性的基序可以选择性的阻断CpG介导的免疫刺激，这些抑制性的基序常常富含重复的G或者GC，往往也是甲基化的。Gursel等［5，6］的研究也显示CpG?N ODN可以阻断CpG?S ODN引起的有害的Th1的活化以及细胞因子的产生，其中一种CpG?N ODN的结构特征为CG的甲基化或者未甲基化的GC序列选择性阻断了CpG引起的免疫活化，另一种以含有重复的TTAGGG序列为特征。Klinman等也发现当刺激和抑制性的基序同时出现在一条单链上时，抑制性基序的作用往往能掩盖刺激性基序的作用，但抑制性基序如果直接位于刺激性基序的3′端就没有抑制作用［7］。Zhao等［8］的研究却提出不是所有的富含GC的都具有抑制活性；Stunz等［9］还报道CGG和CCG序列虽然含有CpG基序，也具有抑制性。

    本研究所采用的CpG ODN 208(5′?TGCCGCGGCAGA?3′)是我们通过对Adv2和Adv5与Adv12、EC DNA进行比较，并应用生物信息学技术重新设计并人工合成的。它含有CpG基序，同时也具有CGG和CCG序列。我们的研究证实CpG ODN 208可以明显地抑制CpG ODN 1826的诱导hPBMC分泌TNF?α的作用，这与Yamada等［10］的结果一致。我们还通过预孵CpG?N ODN和CpG?S ODN，排除了CpG?N ODN的抑制作用是通过与CpG?S ODN直接表面的结合发挥的。

    在Klinman的研究中，CpG?N ODN并不影响刺激性CpG的表面的结合和内化，同时Stunz等［9］也认为CpG?N ODN抑制CpG?S ODN的诱导hPBMC分泌TNF?α的作用是通过影响内体的成熟和与刺激性CpG竞争TLR9而发挥，与影响刺激性CpG的表面的结合和内化无关。但Zhu等［11］发现10μmol/L的CpG?N ODN就可以抑制60%的CpG?S ODN的内化。我们的研究结果显示CpG?N ODN不仅影响hPBMC中巨噬细胞对CpG?S ODN的表面的结合也影响对CpG?S ODN的内化，但这可能仅仅是CpG?N ODN抑制CpG?S ODN刺激作用的途径之一。

    综上所述，CpG?N ODN可以明显地抑制CpS ODN的诱导hPBMC分泌TNF?α的作用，该抑制作用部分可能与CpG?N ODN影响hPBMC对CpG?S ODN的表面的结合和内化有关。

【】
  ［1］ Zhou H, Zheng J, Wang L X, et al. Chloroquine protects mice from challenge with CpG ODN and LPS by decreasing proinflammatory cytokine release ［J］. Int Immuno?pharmacol,2004,4:223

［2］ Hemmi H, Takeuchi O, Kawai T, et al. A Toll?like receptor recognizes bacterial DNA ［J］. Nature,2000,408:74025

［3］ Britigan B E, Lewis T S, Waldschmidt M, et al. Lactoferrin binds CpG?containing oligonucleotides and inhibits their immunostimulatory effects on human B cells ［J］. J Immunol,2001,167(5):2921

［4］ Krieg A M, Wu T, Weeratna R, et al. Sequence motifs in adenoviral DNA block immune activation by stimulatory CpG motifs ［J］. Proc Natl Acad Sci USA,1998,95:12631

［5］ Gursel I, Gursel M, Yamada H, et al. Repetitive elements in mammalian telomeres suppress bacterial DNA?induced immune activation ［J］. J Immunol,2003,171:1393

［6］ Dong L, Ito S, Ishii K J, et al. Suppressive oligodeoxynucleotides protect against the development of collagen?induced arthritis in mice ［J］. Arthritis Rheum,2004,50:1686

［7］ Klinman D M, Yamada H, Gursel M, et al. Regulation of CpG?induced immune activation by suppressive oligode?oxynucleotides ［J］. Ann N Y Acad Sci,2003,1002:112

［8］ Zhao H, Cheng S H, Yew N S. Requirements for effective inhibition of immunostimulatory CpG motifs by neutralizing motifs ［J］. Antisense Nucleic Acid Drug Dev,2000,10:381

［9］ Stunz L L, Lenert P, Peckham D, et al. Inhibitory oligonucleotides specifically block effects of stimulatory CpG oligonucleotides in B cells ［J］. Eur J Immunol,2002,32:1212

［10］ Yamada H, Gursel I, Takeshita F, et al. Effect of suppressive DNA on CpG?induced immune activation ［J］. J Immunol,2002,169(10):5590

［11］ Zhu F G, Reich C F, Pisetsky D S. Inhibition of murine macrophage nitric oxide production by synthetic oligonucleotides ［J］. J Leukoc Biol,2002,71:686