微生物来源的Xa因子抑制剂F02?2172的研究

             作者：路新华 郑智慧 马瑛 石英 董悦生 任晓 穆栋 张华 贺建功

【摘要】  利用一种由本中心建立的Xa因子抑制剂高通量体外筛选模型，从大量真菌菌库及其来源的代谢产物中筛选到了一株可产生阳性活性化合物的菌株F02ZA?2172，该菌株的发酵液经有机溶剂提取、硅胶柱色谱、ODS柱色谱、Sephadex LH?20柱色谱及HPLC制备分离，得到F02?2172A、B和C三个活性化合物。经紫外、质谱、核磁等理化数据分析，确定这三个化合物分别与已知化合物6?epi?ophiobolin K、ophiobolin K和ophiobolin G的结构相同，但该类化合物对Xa因子的抑制活性至今未见报道。

【关键词】  微生物 Xa因子抑制剂 二倍半萜

    F02?2172, factor Xa inhibitors from metabolites of microorganisms

     ABSTRACT  A high throughput screening model was established for screening factor Xa inhibitors from thousands of strains of fungi, as a result, a strain, F02ZA?2172 with potent suppression activity was isolated. The culture broth of it was processed by solvent extraction, silica column chromatography, Sephadex LH?20 column chromatography and ODS HPLC preparation to obtain three pure active compounds named F02?2172A, B and C. Their chemical structures were elucidated as the compounds named 6?epi?ophiobolin K, ophiobolin K and ophiobolin G by physicochemical properties and spectral data of UV, MS, 1H?NMR and 13C?NMR respectively. The compounds are reported as factor Xa inhibitors for the first time.

    KEY WORDS  Microorganisms;  Factor Xa inhibitor;  Sesterterpenes

   血栓的形成是心血管疾病(如心肌梗死、中风、深度静脉血栓、肺栓塞等)重要致病因素，抗血栓一直是这类疾病抢救措施及预防策略的核心，其中抗凝血是抗血栓治疗的重要方法之一，因此，寻找更加安全、高效的抗凝血药物在临床治疗上具有重要的意义。 Xa因子(factor X activated，factor Xa)是一种丝氨酸蛋白酶，位于血液凝集级联的上游，处在连接内源性和外源性激活途径共同通路的中心位置，Xa因子抑制剂既能阻断内源性凝血亦能抑制外源性凝血的发生［1］。Xa因子是凝血酶生成的限速成分，由于在血液凝集级联反应过程中还存在生物信号的放大，估计一个Xa因子抑制剂分子能抑制138个凝血酶分子的生理效果， Xa因子抑制剂可能比凝血酶抑制剂更为有效［2］。Xa因子只单纯促进凝血，没有凝血酶抑制剂的副作用，因此，Xa因子抑制剂成为近年来抗凝血药物研究的热点之一，有些药物已经上市［如Organon公司和Sanofi?Synthelabo公司共同开发的磺达肝素钠(fondaparinux sodium，商品名：方达帕鲁)于2001年12月在美国获得FDA批准［3］］或正在开发中［4］。

    本实验室建立了一个快速的高通量筛选方法，从大量土壤真菌代谢产物中筛选Xa因子抑制剂，筛选得到阳性菌株F02?2172。本文报道其发酵、分离、结构鉴定和生物学活性。

    1  材料与方法

    1.1  筛选用微生物的菌株

    真菌菌株由本中心从云南和新疆采集的土壤中分离得到。

    1.2  试剂及仪器

    Xa因子和底物MCA(Boc?Ile?Glu?Gly?Arg?7?amido?4?methylcoumarin hydrochloride)购自美国Sigma公司；色谱乙腈购自Merck公司；Victor2多标计数仪(美国PE公司)；中压层析系统(德国BUCHI公司)；高效液相系统(美国Waters公司515泵和PDA检测器)；高效液相柱Phenomene C18(20mm×250mm，10μm)；核磁共振仪 500MHz(Inova)；质谱仪(Autospec?Ultima)。

    1.3  Xa因子活性测定方法

    活性测定方法由本中心建立，原理是Xa因子可以水解特定的荧光标记多肽底物，通过荧光值的变化抑制剂对酶的抑制活性。

    活性测定反应在96孔板进行，样品孔中加入0.1mol/L Tris(pH8.0，10mmol/LNaCl，10mmol/L CaCl2)、适量的酶液(Xa因子)和样品的DMSO溶液；对照孔以DMSO代替样品溶液；空白管以DMSO代替样品溶液并以Tris缓冲液代替酶液，在37℃保温15min，测定荧光F1(Ex355nm/Em460nm)；各孔加入底物，37℃保温1h，测荧光F2。其中，抑制率大于80%的样品为阳性。

    样品抑制率(%)=［F2-F1］(对照)-［F2-F1］(样品)［F2-F1］(对照)-［F2-F1］(空白)×100%

    1.4  真菌F02?2172的培养

    将菌株F02ZA?2172斜面接种于种子培养基(淀粉2%，葡萄糖1%，黄豆饼粉0.2%，麦芽粉0.6%，酵母0.5%，CaCO3 0.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，NaCl 0.2%，pH7.0)，27℃，220r/min摇瓶培养3d。按1%接种的量接种到固体培养基(大米97.5%，黄豆饼粉2.5%)27℃培养14d。

    1.5  F02ZA?2172的提取分离

    F02ZA?2172固体培养物2kg，用2000ml乙酸乙酯萃取，减压蒸去溶剂得到深褐色油状物3.5g。上述粗提物经硅胶柱(2.6cm×50cm)色谱，正己烷?乙酸乙酯梯度洗脱，每50ml收集一管，合并活性组分，减压蒸干。活性物质部分用ODS反相中压柱色谱(Merck ODS C18，40μm，1.6mm×50mm)进一步分离纯化，然后用制备型HPLC进行单组分的制备［流动相为CH3CN?H2O(85∶15，V/V)，流速6ml/min，检测波长240nm］，得到F02?2172A(25.0mg)、B(39.3mg)和C(12.4mg)三个活性化合物。

    2  结果

    2.1  F02?2172A、B和C的理化性质及结构

    F02?2172A  无色粉末，易溶于甲醇、丙酮，氯仿，UVλmax(MeOH)为241nm。ESI?MS的测定结果显示该化合物的分子量为384.3，分子式为C25H38O3，1H和13C?NMR数据见Tab.1；经紫外、质谱、核磁等理化数据分析并与［5］对照，确定该化合物为6?epi?ophiobolin K，化学结构见Fig.1。

    F02?2172B  无色粉末，易溶于甲醇、丙酮，氯仿，UVλmax(MeOH)为239nm。ESI?MS的测定结果显示该化合物的分子量为384.3，分子式为C25H38O3，1H和13C?NMR数据见Tab.1；紫外、质谱、核磁等理化数据分析并与文献［5］对照，确定该化合物为ophiobolin K，化学结构见Fig.1。

    F02?2172C  无色粉末，易溶于甲醇、丙酮，氯仿，UVλmax(MeOH)为238nm。ESI?MS的测定结果显示该化合物的分子量为384.3，分子式为C25H36O2，1H和13C?NMR数据见Tab.1；紫外、质谱、核磁等理化数据分析并与文献［6］对照，确定该化合物为ophiobolin G，其化学结构见Fig.1。

    2.2  F02?2172A、B和C的生物活性

    利用本中心建立的体外筛选模型，测定了6?epi?ophiobolin K(F02?2172A)、ophiobolin K(F02?2172B)和ophiobolin G(F02?2172C)三个化合物对与凝血相关的几个酶的抑制活性，它们对Xa因子的活性在1mmol/L浓度以下，对凝血酶(thrombin)和纤溶酶(fibrinolysin)没有抑制活性，IC50分别为27.1、3.39和56.7μg/ml。

    3  讨论

    Ophiobolins(蛇孢假单壳素)是一族具有三环或四环结构的二倍半萜类化合物，具有杀线虫、抗真菌、抗细菌和细胞毒等多种生物活性［7］。Ophiobolin A是该类化合物中第一个被发现的，它的结构是通过其溴甲氧化衍生物的x射线单晶衍射得到的［8］，文献报道该化合物具有抑制钙活化的环核苷磷酸二酯酶和诱导L1210细胞凋亡的作用［9］。Ophiobolin K具有杀线虫的作用，而6?epi?ophiobolin K没有活性［5］。本研究测定了6?epi?ophiobolin K(F02?2172A)、ophiobolin K(F02?2172B)和ophiobolin G(F02?2172C)三个化合物对与凝血相关的几个酶的抑制活性，发现在1mmol/L浓度下它们对凝血酶和纤溶酶没有抑制活性，只特异性的对Xa因子有抑制活性，而且ophiobolin K对Xa因子的抑制活性比6?epi?ophiobolin K和ophiobolin G强8～18倍，进一步的构效关系研究需找到或分离更多的同系物，此项工作正在进行中。

【文献】
  ［1］ Daure E W, Fujikawa K, Kisiel W. The coagulation cascude: Initiation, maintenance and regulation ［J］. Biochemistry,1991,30(42):10363

［2］ Nagahara T, Yokoyama Y, Inamwara K, et al. Dibasic (amidinoargl) propanoic acid derivatives as novel blood coagulation factor Xa inhibitors ［J］. J Pharm Sci,1994,83(9):1200

［3］ Quan M L, Smallheer J M. The race to an orally active factor Xa inhibitor: recent advances ［J］. Curr Opin Drug Discov Devel,2004,7(4):460

［4］ Pancras C, Wong Earl J, Crain Carol A, et al. Nonpeptide factor Xa inhibitors III: effects of DPC423, an orally?active pyrazole antithrombotic agent, on arterial thrombosis in rabbits ［J］. J Pharmacol Exp Ther,2002,303(3):993

［5］ Singh S B, Smith J L, Sabnis G S. Structure and conformation of ophiobolin K and 6?epiophiobolin K from Asper?gillus ustus as a nematocidal agent ［J］. Tetrahedron,1991,47(34):6931

［6］ Wei H, Itoh T, Kinoshita M, et al. Cytotoxic sesterpenes, 6?epi?ophiobolin G and 6?epi?ophiobolin N, from marine derived fungus Emericella variecolor GF10 ［J］. Tetrahedron,2004,60(28):6015

［7］ Au T K, Chick W S, Leung P C. The biology of ophiobolins ［J］. Life Sci,2000,67(7):733

［8］ Morisaki M, Nozoe S, Iitaka Y. X?ray studies of C25 terpenoids I. The crystal structure of ophiobolin methoxybromide ［J］. Acta Crystallogr B,1968,24(10):1293

［9］ Leung P C, Taylor W A, Wang J H, et al. Ophiobolin A. A natural product inhibitor of calmodulin ［J］. J Biol Chem,1984,259(5):2742