白细胞弹性蛋白酶抑制剂筛选模型的建立及抑制剂F02ZA?2554A的研究

         作者：智慧 任晓 司书毅 穆栋 路新华 崔晓兰 董悦生 张华 贺建功

【摘要】  利用人源的白细胞弹性蛋白酶建立了一种快速、微量、灵敏的高通量体外筛选方法。利用该模型从微生物菌种库菌株的次生代谢产物中筛选得到一阳性真菌F02ZA?2554。该菌株发酵液经有机溶剂提取、硅胶柱层析、及HPLC ODS反相柱层析等活性跟踪下的分离纯化，得到活性化合物F02ZA?2554 A，该化合物对白细胞弹性蛋白酶有中等强度的抑制活性，其IC50为32.4μmol/L。通过对该化合物的紫外、质谱、核磁等理化分析，确定该化合物为蒽醌类化合物中的大黄素甲醚(physcion)，该化合物的抗炎活性属首次报道。

【关键词】  人白细胞弹性蛋白酶抑制剂 大黄素甲醚 抗炎作用

    Studies on the high throughput screening assay for HLE inhibitor

      ABSTRACT  Using L?pyroglutamyl?L?prolyl?L?valine?p?NA as the substrate, a high throughput screening assay was developed for screening HLE inhibitors with high S/N ratios (>5) and Z′?factors (>0.85). In screening for HLE inhibitors from metabolites of microorganisms, a compound named F02ZA?2554A was isolated from fungal broth with IC50 of 32.4μmol/L. The spectrum data (UV, IR, MS and NMR) showed that it is physcion, which is the ubiquitous component in many kinds of herbs. These results maybe revealed the mechanism of physcion on anti?inflammation, which has never been reported before.

    KEY WORDS  Human leukocyte elastase inhibitor;  Physcion;  Anti?inflammation

    人白细胞弹性蛋白酶(human leukocyte elastase，HLE)是人体中的一种蛋白水解酶，它直接作用于肺、肝脏、肾脏等结缔组织中的弹性蛋白、胶原蛋白、蛋白多糖等胞外基质。体内弹性蛋白酶表达过多或活性过高均可导致严重的组织损伤，并造成或加重多种如肺气肿、慢性支气管炎、脓血症、肾炎、类风湿关节炎和某些皮肤症等疾病［1～4］。因此，弹性蛋白酶抑制剂已经成为上述疾病药物的重要研发方向之一。另外由于弹性蛋白酶可以破坏胶原纤维及组织基底膜层，在肿瘤的形成和肿瘤转移方面起关键作用，所以弹性蛋白酶已经成为抗癌新药的作用靶点［5，6］。

    本研究利用显色方法建立了一种高通量的人白细胞弹性蛋白酶抑制剂体外筛选模型，经验证该模型快速、灵敏、稳定。为了寻找新的HLE抑制剂，利用该模型对微生物的次生代谢产物进行了高通量的药物筛选， 并从一株真菌的发酵液中分离得到活性化合物F02ZA?2554 A，经结构确定为大黄素甲醚(phys?cion)，该化合物的抗炎活性此前未见报道。本文就模型的建立、阳性菌株的筛选、活性化合物的分离及生理活性进行阐述。

    1  材料与方法

    1.1  筛选用微生物的菌株

    放线菌和真菌由本室微生物菌种库提供，微生物的代谢产物经溶媒提取作为筛选样品。

    1.2  试剂及仪器

    人白细胞弹性蛋白酶(human leukocyte elastase，HLE)和多肽底物均购自Sigma公司；Victor2 1420多标记分析仪(美国PE公司)；GenesysTM 2红外分光光度计(美国Nicolet公司)；质谱(Autospec?Ultima)；核磁共振500MHz(Inova)。

    1.3  HLE活性测定原理及方法

    HLE活性测定原理与方法［7］，并稍加改动。以化学标记的多肽?nitroanilide为底物，利用水解后的产物nitroanilide在405nm有特定吸收，通过测定酶反应前后光吸收A值的变化，确定HLE酶的活性。反应式如下：

    HLE   

    多肽?Val?nitroanilide→多肽+nitroanilide(405nm)

    筛选的操作过程为：在96孔板中加入测试样品，加HLE酶液100μl，再加入2μl的筛选样品，用DMSO作为空白对照。使用Victor2 1420多标记分析仪在405nm波长处读取每孔A值(样品本底A)；加入底物100μl，37℃保温反应120min后再次读取每孔的A值，并抑制率。

    抑制率(%)=［A2-A1］(对照)-［A2-A1］(样品)［A2-A1］(对照)-［A2-A1］(空白)×100%

    1.4  F02ZA?2554的培养

    将菌株F02ZA?2554斜面接种于种子培养基(淀粉2%，葡萄糖1%，黄豆饼粉0.2%，麦芽粉0.6%，酵母0.5%，CaCO3 0.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，NaCl 0.2%，pH7.0)，27℃摇瓶培养3d。按1%接种的量接种发酵培养基(淀粉1.0%，葡萄糖2%，黄豆饼粉1.3%，酵母粉0.4%，麦芽粉0.8%，NaCl 0.05%，CaCO3 0.15%，pH7.0)27℃振摇培养6d。

    1.5  F02ZA?2554A的分离纯化

    F02ZA?2554发酵液1000ml于3000r/min离心15min，分别收集菌体与上清，菌体用1000ml丙酮提取后，蒸去丙酮，用1000ml乙酸乙酯抽提二次，乙酸乙酯层经无水Na2SO4脱水，浓缩抽干后得到褐色物质2.3g。取1g样品，用少量甲醇溶解后，使用硅胶柱(2.5cm×25cm)层析进行分离纯化，洗脱系统为氯仿∶甲醇，收集合并活性组分，浓缩抽干后得固体62mg。将该活性组分在制备型HPLC(Waters 996 PDA)ODS反相柱(Phenomenex 20mm×250mm，10μm)进行单组分的制备(流动相为50%乙腈，流速6ml/min，检测波长210nm)，得到橙黄色物质F02ZA?2554A 7.8mg。

    2  结果与讨论

    2.1  筛选模型的建立

    利用96孔板，在底物终浓度为10mmol/ml的条件下，加入不同稀释浓度的HLE，测定不同HLE的酶量与A值的关系。结果表明在酶量0.5×10-4～8×10-4U/ml范围内与A值之间均呈很好的线形关系(图1)。 将模型筛选时每孔的酶量确定为4×10-4U/ml。以乌司他丁注射针剂的原粉作为阳性对照测定对HLE的抑制活性，评价模型的灵敏度和稳定性。结果表明乌司他丁在该模型上表现出强抑制活性，并具有较好的量效关系(图2)，其IC50为1.1μmol/L，筛选模型的Z′因子>0.85，信噪比(S/B)>5。

    2.2  F02ZA?2554A对HLE的抑制活性

    取浓度梯度稀释(100→1μmol/L)的F02ZA?2554A对HLE进行活性测定，结果见图3。该化合物对HLE的抑制作用呈现较好的浓度依赖性的关系，IC50为32.4μmol/L，具有中等的抑制活性。

    2.3  F02ZA?2554A的理化性质及结构由FAB?MS的测定显示该化合物的分子式为C16H12O5，分子量为284。并且对F02ZA?2554 A进行了核磁(CD3OD?4)1H?NMR和13C?NMR谱的测定，数据见表1。

    根据F02ZA?2554 A的理化性质、分子量、UVλmax(MeOH)以及在CD3OD?d4中的1H?NMR及13C?NMR数据，并结合检索［8，9］，最后确定该化合物为蒽醌类的大黄素甲醚，化学结构见图4。

    3  讨论

    据统计，近几年来肺部感染的人数增长幅度较大，已成为继心脑血管和癌症之后的第三大致死原因，对急性肺损伤的，目前临床上缺少候选药，所以开发HLE抑制剂已经成为治疗炎症相关疾病药物和抗癌药物研发热点之一。西维来司钠(sivelestat sodium hydrate)是日本小野公司2002年4月开发的全球首个治疗伴有全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)的急性肺损伤弹性蛋白酶抑制剂药物［10］。全身性炎症反应综合征大多是由严重感染、严重创伤及胰腺炎等诱发，能引起与重症 表1    F02ZA?2554A的碳谱和氢谱数据(DMSO?d6)炎症或局部炎症无直接关系的肺、肝脏、肾脏等多脏器功能障碍，病情严重时造成死亡，其中中性粒细胞及其释放的弹性蛋白酶起了重要作用。西维来司钠能选择性地抑制中性粒细胞释放弹性蛋白酶，改善呼吸功能，缩短患者使用呼吸器的时间，降低安装呼吸器引起的压力性损伤及呼吸道感染症的并发率，改善SIRS及特发性肺纤维化等引发的急性肺损伤。另外，西维来司钠除了在肺部损伤和肺部感染上的用途外，还用于急性胰腺炎、急性肾炎的临床治疗。2002年我国暴发SARS时期，在治疗重症患者的临床治疗方案中除了抗生素和激素以外，西维来司钠成为第一个被国家食品药品监督管理局(FSDA)批准进入临床试验的抗非典药物。

    乌司他丁(ulinastain)是从健康成年男性新鲜尿液中分离纯化得到的一种分子量66470.7u的糖蛋白，是一种广谱的蛋白酶抑制剂，对粒细胞弹性蛋白酶、胰蛋白酶、透明质酸酶等多种酶有抑制作用，具有减少组织、细胞的损伤；改善循环、改善组织灌注；抗炎、抑制过度炎症反应，临床用于治疗急性胰腺炎、休克以及肿瘤化疗中预防肾中毒及肝、肾移植手术等［11］。本研究利用乌司他丁作为阳性对照，验证了筛选模型的稳定性和灵敏度，具有较好的量效依赖关系，信噪比高(S/B>5)，Z′因子>0.85，提示该模型可高通量应用于筛选［12］。

    筛选中得到的活性化合物F02ZA?2554A经结构解析确定为蒽醌类大黄素甲醚。蒽醌类化合物在植物中分布较广，并具有多种生物活性，如中药紫草中的紫草素类化合物具有止血、抗炎、抗菌、抗癌等作用。本研究结果表明大黄素甲醚对白细胞弹性蛋白酶具有中等的抑制活性(IC50=32.4μmol/L)。Zembower等［13］曾报道他们利用合成方法得到的新的蒽醌类化合物具有抑制HLE的活性(IC50=4～10μmol/L)，由此推测蒽醌类化合物具有的抗炎和抗癌活性的机制之一有可能与其抑制HLE相关，初步揭示了蒽醌类化合物的药理机制。

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