高效液相色谱法测定半边旗中木犀草素的含量
作者：吕应年 吴科锋, 邓亦峰, 梁念慈
【关键词】 高效液相色谱；,,半边旗；,,黄酮；,,木犀草素
摘要：目的建立草药半边旗中木犀草素含量的准确测定方法，并测定不同采收期半边旗中木犀草素的含量。 方法采用高效液相色谱法，色谱柱为Diamonsil C18，流动相为甲醇水梯度洗脱，流速0.2 ml・min1，检测波长为283 nm，柱温度35℃。结果木犀草素进样量在0.062~0.62 μg范围内线性关系良好（R2=0.998 7），平均回收率为99.5％(RSD=1.98%)。 结论 该方法操作简便，结论可靠，可用于半边旗草药的质量控制。
关键词： 高效液相色谱； 半边旗； 黄酮； 木犀草素
Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method for content determination of luteolin from PSL.MethodsThe separation was performed on a Diamonsil C18 column, the mobile phase was run with a mixture of methanol(B) and water(A) with a linear gradient elution at a flow rate of 0.2 ml・min1, the ultraviolet wavelength was 283 nm, and the column temperature was maintained at 35℃. ResultsThe calibration curve showed good linearity in the range of 0.062~0.62 μg（R2=0.998 7）, the average recovery was 99.5%(RSD=1.98%). ConclusionThe method is simple, convenient and accurate and can be used for the quality control of PSL.
Key words：HPLC; Pteris Semipinnata; Flavonoid; Luteolin
半边旗Psteris semipinnata L.又名半边蕨、半边莲、单边旗，系凤尾蕨科植物，是一种南方常用生药，始载于《岭南采药录》，称半边旗。有止血、生肌、解毒、消肿之功效，民间用于吐血、外伤出血、发背、疔疮、跌打损伤、目赤肿痛等［1］。研究表明，半边旗中含有挥发油、萜类、黄酮、皂苷等多种物质［2］。有关半边旗的药效成分研究主要集中在萜类化合物［3，4］。关于半边旗中黄酮类物质药学研究尚未见报道。本课题组曾用分光光度法测定半边旗黄酮的含量［5］，但该法主要用于植物提取物总黄酮的含量测定，不适合于对黄酮单体的分析。本文采用高效液相色谱对半边旗的黄酮单体木犀草素进行研究，建立了半边旗中木犀草素含量的测定方法，并测定不同采取收期半边旗的黄酮单体木犀草素进行研究，并测定不同采收期半边旗中木犀草素的含量，为植物半边旗的广泛开发利用奠定基础。
1 仪器与试剂
1.1 仪器岛津 LC10A高效液相色谱仪（LC10ATVP泵，SCL10AVP控制器，SPD10 AVP紫外检测器，CTO10AVP柱温箱），梅特勒 AE240型分析天平。
1.2 木犀草素对照品购于天津尖峰天然产物研究开发公司。
1.3 半边旗草药采收于广东湛江郊区，经成都中医药大学苟占平博士鉴定为半边旗全草。
2 方法和结果
2.1 色谱条件色谱柱Diamonsil C18 (150 mm×4.6 mm，5 μｍ)；紫外检测波长283 nm；流动相为甲醇水溶液， 0%~100％梯度洗脱；流速0.2 ml・min1；柱温为35℃。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的配制精密称取木犀草素对照品0.00124 g，置10 ml容量瓶中，加甲醇超声溶解，定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.124 g・L1 的木犀草素对照品储备液。精密吸取储备液0.1，0.3，0. 5，0.7，1.0 ml，分别加入甲醇定容至1.0 ml，摇匀，即得含木犀草素对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的配制按［5］的方法制备半边旗提取物，称取半边旗提取物约5 g，先后加氯仿、醋酸乙酯索氏提取至无色，蒸干醋酸乙酯提取液得半边旗黄酮，精密称取半边旗黄酮约100 mg，置100 ml容量瓶中，加甲醇超声使溶解，定容至刻度，摇匀。经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.3 系统适应性及专属性实验分别取对照品溶液、供试品溶液各5 μl进样色谱仪，记录色谱图如图1。在上述色谱条件下木犀草素出峰时间28 min，供试品在木犀草素峰相应位置有一显著峰。实验结果表明该方法能使半边旗黄酮较好分离，色谱系统的适应性及专属性良好。
a木犀草素标准品 b半边旗黄酮供试品
图1 色谱图（略）
2.4 线性关系的考察分别精密量取上述对照品溶液各5 μl进样，以色谱峰面积（Y）对质量（X）进行回归，木犀草素的线性回归方程为Y=408 058X，R2=0.998 7，线性范围为0.062～0.62 μg。
2.5 精密度实验取对照品储备液5 μl，连续进样6次，测得木犀草素峰面积RSD均为0.84%，表明仪器进样精密度良好。
2.6 稳定性实验取供试样品溶液5 μl，分别在0，3，6，12，16 h进样，测定木犀草素的峰面积RSD为1.34%，表明样品溶液在16 h内稳定。
2.7 重复性实验取同一批半边旗草药，按供试品制备方法配制6份，分别进样5 μl，测定木犀草素的含量RSD为1.64%，表明该方法的重现性较好。
2.8 加样回收率实验取同一供试品5份，分别加入木犀草素对照品，按供试品溶液制备方法制备样品，进样5μl，得回收率分别为99.5%，RSD 1.98%。结果见表1。
2.9 样品含量测定取不同采收期的半边旗全草，按供试品制备方法制成样品溶液，各取5 μl进样，测定峰面积，由线性方程计算得木犀草素的含量见表2，对照品及供试品色谱图见图2。
表1 木犀草素的加样回收率实验结果（略）
表2 半边旗草药中木犀草素含量测定（略）
图2 木犀草素标准曲线（略）
3 讨论
黄酮类化合物是中草药中一类重要的药效成分，木犀草素是一种很具有代表性的天然黄酮［6］，属弱酸性四羟基黄酮类化合物，在植物界分布较广，从半边旗中提取分离的黄酮部位含有木犀草素。木犀草素有很强的抗氧化活性，有关药理及临床实验的结果还表明木犀草素在体内具有抗菌、抗病毒及降低血脂和胆固醇的作用［7，8］。采用HPLC法测定半边旗中木犀草素的含量，方法稳定，快速，重现性好，杂质干扰小，适合半边旗中木犀草素的含量测定。从含量测定结果看出，半边旗中木犀草素含量不高，在不同采收期，半边旗中木犀草素含量有较大差别，8、9月份采收的半边旗中木犀草素含量最高，实验结果可为半边旗适当的采收季节资源利用提供指导，为相关制剂的质量研究提供实验依据。
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