无定形磷酸钙负载rhBMP?2纳米缓释体的制备及细胞毒性实验
【摘要】 制备无定形磷酸钙(ACP)负载重组人骨形态发生蛋白?2(rhBMP?2／ACP)纳米缓释体并观察其细胞毒性，为进一步体内植入提供实验依据。 ［方法］采用湿化学法合成rhBMP?2／ACP纳米缓释体；兔间充质干细胞(BMSCs)与rhBMP?2／ACP纳米缓释体进行体外复合培养，观察细胞在材料表面的黏附、增殖及功能表达，检测材料的细胞毒性。［结果］材料浸提液对兔BMSCs的生长无影响，其细胞相对增殖率在100?2％～102?5％之间，细胞毒性评级为0级；BMSCs于复合材料表面的黏附、生长速度、形态与对照组无明显差别。［结论］rhBMP?2／ACP纳米缓释体无细胞毒性，复合培养不影响BMSCs的正常生理功能，细胞相容性良好。
【关键词】 重组人骨形态发生蛋白-2 无定形硫酸钙 细胞培养 骨髓间充质干细胞 细胞毒性
Abstract:［Objeetive］ To develop the recombinant human bone morphogenetic protein?2(rhBMP?2)loaded amorphous calcium phosphate(ACP)delayed release nano?sized material，investigate its cytotoxicity of cell，and provide a reference for the experiment of composite material in vivo．［Method］The rhBMP?2／ACP delayed release nano?sized material were prepared by chemical wet method and cultured on rabbit bone marrow?derived mesenchymal stem cells(BMSCs)in vitro．Then the adhesion，proliferation，growth and functional expression of BMSCs were measured．［Result］Cytotoxicity test demonstrated that rhBMP?2／ACP delayed release nano?sized material had not affect the percentage of cell’s proliferation with material?extracted liquid cultured with BMSCs and the cytotoxicity was graded zero．The adhesion，proliferation，configuration of the cells on the surface of this material were identical to the control group．［Conclusion］It was suggested that rhBMP?2／ACP delayed release nano?sized material might have good cellular biocompatibility,no cytotoxicity and not effected the normal functional expression of BMSCs in vitro．
Key words:rhBMP?2；amorphous calcium phosphate；cell culture；BMSCs；cytotoxicity
目前，骨修复替代材料的研究在生物取材、细胞的体外培养、支架材料复合体等诸多方面积聚了丰厚的基础。无定形磷酸钙(amorphous calcium plosphate，ACP)是在采用湿化学法合成羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)时发现一种磷酸钙的无定形中间相，是一类X射线衍射为非晶态的磷酸钙材料的总称，具有典型的无定形物质的球形面貌。研究发现ACP的骨传导及细胞黏附性能优于HA〔1〕，生物降解速率高于磷酸三钙〔2〕，可降解可任意塑形，其化学组分、磷酸钙颗粒的表面形态、表面亲水性等，能满足药物分子和人体细胞对载体的多重要求〔3〕，但ACP不具备诱导成骨能力、降解速率不易控制等缺点。作者采用ACP包裹重组人骨形态发生蛋白?2(recombinant human bone morphogenetic protein?2，rhBMP?2)，通过湿化学法合成技术，制备出rhBMP?2／ACP纳米缓释体，以期发挥单一材料的原本优势，克服ACP的劣势和rhBMP?2易被体液稀释及蛋白酶分解不能充分发挥成骨诱导活性等不足，进一步提高材料的综合性能。本研究在rhBMP?2／ACP纳米缓释体研制等前期实验的基础上，观察兔骨髓间充质干细胞(bone marrow?derived mesenchymal stem cells，BMSCs)在材料表面的黏附、增殖及功能表达，评价其细胞毒性。
1材料和方法
1?1rhBMP?2／ACP纳米缓释体的制备
在ACP原研技术条件下〔4〕，取适量K2HPO4、CaCl2分别溶于乙醇形成A、B液，rhBMP?2溶于A液，于B液中添加适量有机物静置过夜后，将A液缓慢滴加到B液中，在反应体系中加入0?1 mol的NaOH以使pH保持在7左右，反应2 h，经抽滤、洗涤，脱水干燥，获得rhBMP?2／ACP纳米缓释体。经X线衍射检测成品表征为无定形相；扫描电镜观察纳米颗粒均匀圆整，具有较好的球形形貌(图1)。纳米缓释体中rhBMP?2释放起始量1 d为(13?99±1?66)％，呈现快速释放，随后则维持有效浓度持续缓慢释放，30 d时累积释放量为(45?76±4?60)％(图2)，符合双向动力学释放。
1?2rhBMP?2／ACP纳米缓释体的细胞毒性实验
1?2?1实验材料
1?2?1?1主要试剂：DMEM培养液(美国Gibco)；胎牛血清(杭州四季青)；胰蛋白酶(美国Sigma)；MTT试剂(南京创瑞)；二甲基亚砜(DMSO，南京创瑞)；碱性磷酸酶试剂盒(ALP，南京建成)。
1?2?1?2主要仪器：倒置相差显微镜(德国Zeiss)；光学显微镜(日本Olympus)；扫描电镜(日本Hitachi)；超净台(苏州净化仪器厂)；细胞培养箱(德国Herabus)；台式高速普通离心机(德国Heraeus)；低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂)；酶标仪(美国BIO?RAD)；微量移液器(法国Gilson)；电热恒温水浴箱(上海医用恒温设备厂)。
1?2?2材料浸提液制备
取rhBMP?2／ACP纳米缓释体实验材料(以下简称实验材料)的固相粉末3g，经60Co 25 kGy辐射灭菌后，浸入30 ml浸体介质(含10％胎牛血清的DMEM培养液)中，置37 ℃、5％CO2、100％湿度孵育箱内静置浸提，10 d后取其上清液移入无菌玻璃容器内密封备用。
1?2?3材料试件制备
将湿化学法合成制备的实验材料、对照材料(ACP由南京大学提供)预制成直径2 mm，厚度为3 mm圆形标准试件，聚乙烯塑料袋双层包装，经60Co 25 kGy辐射灭菌后备用。
1?2?4实验方法
1?2?4?1BMSCs细胞的分离与培养取出生3 d内的乳兔(南京金陵种兔场提供)，颈椎脱臼法处死后置于75％酒精中浸泡20 min消毒，无菌条件下取双侧肱骨以及股骨，剔去肌肉组织，用含10％胎牛血清的DMEM培养液冲洗髓腔以及干骺端，以107个／ml的细胞密度接种于培养瓶中，置37 ℃、5%CO2、饱和湿度的孵育箱内培养，48 h后弃去未贴壁的细胞，更换新鲜培养液，以后每3 d更换一次培养液，细胞长到80％融合时，用0?25％的胰蛋白酶消化，按104个／cm2的细胞密度传代培养，以第3代细胞作为实验细胞。
1?2?4?2细胞增殖率检测(MTT法) 将常规收集的第3代BMSCs，用0?25％胰酶消化计数后分为2组：实验材料组加100％浸提液，对照组加DMEM培养液，每组复种8孔，置37 ℃、5％CO2、100％湿度孵育箱内静置培养，倒置显微镜观察细胞生长形态；于接种后2 d、4 d、6 d和8 d，分别进行MTT检测：每孔加入MTT溶液20 μl，培养4 h后用移液器吸除孔内培养上清液，再于每孔内加入DMSO150 μl，振荡5 min，待完全溶解后，置酶标仪500 nm波长处测定各孔吸光光度值，各组所测结果取平均值，细胞相对增殖率(relative growth rate，RGR)。RGR=实验组吸光度值／对照组吸光度值×100％。
1?2?4?3细胞黏附率检测将实验材料试件置入培养板孔内，调整密度为5×105／ml的细胞悬液滴加到材料上，置孵育箱内培育4 h，PBS缓冲液冲洗，去除未黏附的细胞，以0?25％的胰酶消化计数后计算细胞黏附率。黏附率=黏附细胞数／总细胞数×100％。设相同面积ACP材料作为对照。
1?2?4?4细胞形态观察将实验材料试件安放于24孔培养板孔底，与1×105／ml密度的BMSCs直接接种于材料上，常规培养8 d后取出试件，以3％戊二醛固定，PBS缓冲液漂洗3次，30%～100％梯度乙醇脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金，扫描电镜观察。
1?2?4?5ALP含量检测取第3代BMSCs与实验材料(ACP材料为对照)复合培养，分别于2 d、4 d和8 d终止，弃去培养液，PBS缓冲液漂洗3次，每孔加入Tritonx l00细胞裂解液100 μl，4 ℃24 h充分裂解细胞，酶标仪450 nm处测定各孔吸光度值，ALP含量。
1?2?5统计学方法
采用SPSS10?0统计软件处理，数据用均数±标准差(±s)表示，单因素方差分析，P＞0?05为无显著性差异。
2结果
2?1细胞相对增殖率(MTT法)
RGR实验材料组为100?2％～102?5％，空白对照组为100％，两组间无显著性差异(P＞0?05)；两组细胞毒性评级均为0级。表明实验材料对兔BMSCs无细胞毒性(见表1)。
2?2细胞黏附率测定
BMSCs在实验材料表面的黏附率为(83?8±8?6)％，对照组为(78?9±7?2)％，两组间差异无统计学意义(P＞0?05)。
2?3细胞生长形态观察
倒置相差显微镜下观察：贴壁细胞胞膜完整，胞浆饱满，胞核明显，具有正常的细胞形态(图3)。2 d时实验材料边缘可见细胞附着生长，细胞多呈梭形，似成纤维细胞(图4)。4 d时细胞在材料完全铺展，细胞形态为梭形、多角形，胞体伸出细长突起，生长趋势良好。第8 d细胞已铺满瓶底，呈多层集结，排列无。动态观察中，未见细胞形态发生改变。传代细胞形态与原代相似。扫描电镜可见实验材料表面及孔隙中有大量细胞黏附、增殖、生长，细胞呈梭形或多角形，并从胞体伸出数量不等、长短不一、形态各异的突起，相互，生长活跃(图5、6)。表1MTT检测结果及细胞毒性分级
测定时间点实验组OD值(±s)RGR(%)毒性分级对照组OD值(±s)RGR(%)毒性分级2 d0?323±0?023102?500?315±0?023100?004 d0?686±0?025100?400?683±0?020100?006 d0?935±0?022100?200?933±0?021100?008 d1?227±0?025100?201?225±0?019100?00图1扫描电镜下材料的形态图图2rhBMP?2累积释放曲线图3倒置相差显微镜下观察第3代BMSCs细胞形态图4实验材料与BMSCs共培养第2 d细胞形态图5、6扫描电镜下实验材料与BMSCs共培养第8 d细胞形态(×400，×1500)2?4ALP含量测定
各时间点ALP含量见表2，2 d时两组ALP无明显差别(P＞0?05)，随培养时间的增加，实验材料组明显高于ACP材料组，两组间差异有统计学意义(P<0?05)。表2两组材料各时间点ALP含
3讨论
理想的载体材料应具备与种子细胞的良好相容性、形状的可塑性、易降解性和低抗原性等优点〔5〕。 羟基磷灰石、磷酸三钙和生物活性玻璃等无机高分子材料具备良好的材料组织界面，但材料脆性大，不易降解或降解速率难以控制，故应用受到限制。ACP是一种不同于羟基磷灰石和磷酸氢钙的混合物，进程结构近似于磷灰石的Ca6(PO4)6团族和β相磷酸三钙的Ca3(PO4)2团族〔6〕。以湿化学法合成制得的rhBMP?2／ACP纳米缓释体，期望能优势互补，充分利用ACP在生物矿化过程中显现出的无定形物质各向同性的特点以赋予骨骼较高的力学性能，以及可降解、可任意塑形、通过改变组分进行调节〔1〕等特性和rbBMP?2良好的诱导成骨作用〔7〕，寻求一种具有良好的生物活性、细胞黏附性、细胞相容性及可控的生物降解速率与新骨生成速率相匹配的骨修复替代材料。本实验制备品经检测纳米缓释体的物性、粒径、表面形貌等保持了原材料的基本属性。其负载的rhBMP?2具有较好的体外释放起始浓度，且能维持相应浓度持续缓释，释放规律与BMSCs向成骨细胞分化的时间相符，表明ACP球形纳米微观结构的高吸附性，能负载更多的活性因子，而表面微结构较低的粗糙度则能为细胞的黏附提供更多的附着点，为细胞行使功能建立适宜的框架基础和代谢场所。ACP负载rhBMP?2后，有效控制了外源性生长因子在局部持续有效浓度的释放，并保持着良好的生物活性，发挥了rhBMP?2诱导成骨的良好效能。复合培养结果显示，实验材料细胞黏附率、RGR及ALP测定指标与ACP材料相比均有不同程度提高，表明实验材料较ACP材料更有利于细胞的黏附，并为细胞在其表面的生长、增殖及分泌基质提供了良好的微环境。
对生物材料进行细胞毒性试验是检测材料细胞相容性的基本内容，常以体内或体外方法检测。体内植入法因受体内多种因素影响难以单独反映生物材料与细胞的相容性，故本实验选择细胞体外复合培养法，通过直接观测材料浸提液或材料表面种植细胞的形态变化与数量增减及功能表达等，可准确判定受试材料对细胞的毒性大小。作为对受试材料细胞毒性的初步评价，该方法具有简便快捷、敏感直观、重复性好等优点〔8〕。目前最为常用的MTT法，利用活细胞中的线粒体琥珀酸脱氢酶将MTT还原成难溶的蓝紫色甲瓒晶粒，而DMSO可溶解该结晶物显色，通过检测其吸光度值间接反映活细胞的生长、增殖等情况。本实验采用兔骨髓取材便利，经分离液离心分层后，单核及有核细胞较易析出，分离培养简单易行，BMSCs体外培养扩增后与实验材料浸提液混合培养，MTT检测能快速对材料的细胞毒性做出可靠的定量评定。细胞毒性通常随溶出物浓度的增高而增大，本实验应用浸提10 d获得的高浓度浸提液以便细胞毒性的显现。实验结果实验材料对BMSCs增殖没有影响，RGR＞100％，细胞毒性评级为0级，表明受试材料无细胞毒性；活细胞数量随培养时间的延长逐渐增多，各时间点活细胞数实验组高于对照组，说明受试材料对BMSCs的增殖有促进作用：直接接种于实验材料表面的BMSCs黏附、增殖良好，生长形态、速度与对照组无明显差别，进一步证明受试材料具有良好的细胞亲和性。细胞与材料的黏附是细胞增殖和分化的基础，ALP被认为是细胞外基质成熟的早期标志，在BMSCs体外成骨中促使基质矿化，可间接反映细胞的成骨活性。ALP活力是细胞早期分化的重要指标，本实验ALP活性实验组明显优于对照组，表明实验材料对BMSCs向成骨细胞的定向分化有良好的诱导作用，可能和骨诱导生长因子与适宜载体缓释系统结合形成的微环境有关。
本研究通过实验材料与活细胞体外接触实验证实，材料与BMSCs可良好黏附并使其增殖。不具有细胞毒性，ACP复合rhBMP?2增高了细胞黏附率。增强了细胞ALP活性，缓释系统的构建环境有利于种子细胞的生长和功能表达，表现出良好的细胞相容性，为进一步行rhBMP-2／ACP纳米缓释体体内植入提供了实验依据。
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