正交试验优选蜗牛多糖提取工艺的研究
作者：湛孝东 王克霞 李朝品
【摘要】 目的：探讨蜗牛多糖的最佳提取工艺。方法：运用正交试验对浸体时间、温度、料液比和乙醇浓度4个因素进行优选。结果：蜗牛多糖提取条件的最优组合为：浸提时间6h、浸提温度70℃、料液比1︰30和乙醇浓度90%。结论：优选的蜗牛多糖提取工艺稳定可行，能有效提高蜗牛多糖得率。
【关键词】 正交试验 蜗牛多糖 提取 优选
多糖是广泛存在于有机体内的一种重要信息分子的受体，它参与分子识别、细胞黏附以及机体防御等过程的调节，使多糖具有抗病毒、抗肿瘤、免疫增强、降血糖、抗凝血和抗衰老等多种生物学活性。此外，多糖大多提取于动植物，是一类毒副作用小的天然药物，因此受到广泛关注。我们发现蜗牛多糖具有抗病毒和增强免疫等活性[1～2]。但目前的蜗牛多糖提取工艺存在得率较低的缺点，我们采用正交试验的方法对现有工艺进行了优化，结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 试剂和议器 试剂：无水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、葡萄糖等，以上试剂均为分析纯。仪器：恒温磁力搅拌器，国华电器；天平，瑞士Metller；真空干燥箱，上海一恒；UV1600紫外-可见分光光度计，日本岛津。
1.2 实验方法
1.2.1 正交试验设计 参照预实验及资料，选取浸体时间、温度、料液比和乙醇浓度4个因素，每个因素3个水平，采用L9（34）正交表，见表1。表1 因素水平表
1.2.2 多糖提取 新鲜活体条华蜗牛（Cathaica fasciola），去壳，清水洗净干燥后精确称取200g，按正交试验设计的因素水平，文献方法[3]，提取蜗牛多糖。
1.2.3 标准曲线绘制及多糖含量测定 采用苯酚-硫酸比色法，操作步骤如下；精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖60mg，置100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，即为葡萄糖标准液。精密吸取上述溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0ml，分别置于50ml容量瓶中，加蒸馏水定容。精密吸取上述溶液各2.0ml，置试管中，然后各管加入5%苯酚1ml，摇匀后迅速加入浓硫酸7ml，5min后置40℃水浴中加热30min，取出置冰水浴5min。以同样处理的蒸馏水作空白。490nm处测定吸光度A。以A值为纵坐标，以葡萄糖标准液浓度C为横坐标，绘制标准曲线。
根据蜗牛多糖吸光度及标准曲线回归方程出蜗牛多糖浓度，并计算得出其含量。
2 结果
2.1 正交试验结果 不同浸体时间、温度、料液比和乙醇浓度正交试验结果见表2。
2.1.1 直观分析 从表2可以直观看出浸体时间、温度、料液比和乙醇浓度对蜗牛多糖得率都有影响，主次因素顺序为：A＞B＞D＞C。蜗牛多糖提取条件的最优组合为：A2B2D3C3，即浸提时间6h、浸提温度70℃、乙醇浓度90%和料液比1︰30。
2.1.2 方差分析 结果见表3。表3 正交试验结果方差分析方差分析的结果表明，浸提时间和浸提温度对多糖的得率有显著性影响（P＜0.05）。
2.2 标准曲线方程及多糖含量 不同浓度的葡萄糖标准液对应的吸光度A值分别为0.092、0.138、0.233、0.444、0.565和0.702。出的葡萄糖标准曲线的回归方程为：A=0.022C－0.092，r=0.986。根据葡萄糖标准曲线的回归方程计算出蜗牛多糖含量的平均值为82.1%。
2.3 验证试验 精密称取蜗牛3份，每份200g，以上述蜗牛多糖最佳提取工艺进行提取。测得蜗牛多糖
含量平均值为81.3%，RSD=1.82%，验证结果说明该工艺稳定可行。
3 讨论
在正交设计优选提取条件中，我们得出的最佳乙醇浓度为90%，但是考虑到提取成本的因素，我们实际使用的乙醇终浓度为70%，然后通过反复多次沉淀。这既节约了成本又提高了多糖纯度，效果较理想。
现有报道的多糖提取方法大多为植物多糖和菌类多糖，这类多糖的共同特点是成份单一，水溶性较好，因此提取过程较为简单。但蜗牛多糖大部分为蛋白多糖，因此分离较困难，这是蜗牛多糖得率不高的主要原因。此外动物多糖往往还含有脂类，脱脂是否完全直接影响多糖的纯度和得率。本研究其他贝类多糖的提取方法，采用甲醇温和脱脂的方法，避免了对多糖结构的破坏，取得了较好效果。
但从实验结果可以看出，同以往文献报道相比[4]，动物多糖的得率较植物多糖低，可能的因素有两个：一方面动物与植物体内有机物质构成不同，动物的脂肪和蛋白质含量比植物高出许多；另一方面可能是提取方法还不完善。动物多糖特别是贝类多糖的提取工艺还有待深入研究。
【参考文献】
[1] 湛孝东，王克霞，李朝品，等．蜗牛多糖的提取和免疫学活性研究[J]．时珍国医国药，2006，17（11）：2191～2192．
[2] 王克霞，湛孝东，李朝品，等．江西巴蜗牛多糖对乙肝病毒复制的抑制作用研究[J]．药通报，2006，22（3）：378～379．
[3] 张 璐，刘 强．茯苓多糖制备工艺及药理作用研究进展[J]．中国实验方剂学杂志，2006，12（4）：61～64．
[4] 苏延友，苏延峰，杨杰．正交试验法优选黄伞多糖提取工艺的研究[J]．食用菌，2004（1）：10．
