黄芪复方对大鼠主动型Heymann肾炎的作用
作者：王迎新 方永红 魏伟 钱善军 李卫平 陈敏珠
【摘要】 目的：研究黄芪复方对大鼠主动型Heymann肾炎的作用，并探讨其作用机制。方法：大鼠腹腔注射同种肾脏免疫复合物，复制大鼠主动型Heymann肾炎模型，观察灌胃给予黄芪复方三种剂量1.5、0.75、0.375g浸膏/kg（折合生药4、2、1g/kg），治疗大鼠H基残留冻土层eymann肾炎4周，对Heymann肾炎模型的作用。结果：①能明显降低肾炎大鼠尿蛋白，血清肌酐与尿素氮，能升高血清总蛋白与白蛋白水平；②能明显提高血清SOD活性和降低血浆MDA含量；③能使肾炎大鼠降低的胸腺及脾脏指数以及脾淋巴细胞ConA增殖反应恢复，使IL-1水平明显降低。结论：黄芪复方对大鼠Heymann肾小球肾炎有明显的保护作用，该疗效可能与其抗炎、抗氧化和免疫调节等作用有关。
【关键词】 黄芪复方 大鼠 Heymann肾炎
Effects of Huang-Qi-fu-fang on Heymann nephritis in rats
【Abstract】Objective:In order to study the effects of huang-qi-fu-fang on nephritis in rats and the reasonality of the compound and try to find out the mechanisms of Huang-qi-fu-fang.Methods:The rat models of AHN were induced by intra peritoneal administration of kidney homogenate and Freund's adjuvant.We studied the effects of huang-qi-fu-fang which was given orally at the dosages of 4,2,1g/kg crude drug body weight on Heymann nephritis for 4 weeks in rats.Results:①the levels of proteinuria and blood urea nitrogen and creatinine in all treated groups were remarkedly decreased.②The concentrations of serum cholesterol and triglycerides and plasma,MDA were obviously descreased after treatment ,but the levels of serum total protein and albumin and the activity of SOD were mardedly increased. ③this compound could restore the diminshed indexes of thymus and spleen,proliferative response to splenocyte induced by Con A and enhanced IL-1 production by peritoncal macorophages in HG rats.Conclusion:The protective offects of Huang-qi-fu-fang on Heymann nephritis in rats were associated with its anti-inflammatory,anti-oxidative and immunomodulatory activities.
【Key word】Huang-qi-fu-fang rat Heymann nephritis
1 前言
黄芪复方是以黄芪为主药与另二味中药组成的复方，黄芪被历代视为补气要药[1]。本草纲目记载“可治一切气衰血虚诸证”。医学研究表明，黄芪具有降压、利尿、强心、抗炎、镇痛及免疫调节等作用。单独或与其他药配伍用于治疗慢性肾炎，在临床上取得了较为满意的效果。目前医学研究认为免疫学机制、肾血凝障碍及氧自由基代谢失衡等在肾炎的发病机理中具有重要作用[2]。本文采用大鼠主动型Heymann肾小球肾炎模型以及多项指标，观察黄芪复方对实验性肾炎的防治作用，为本方的气血双补、活血促消治疗慢性肾炎的论点提供基础。
2 材料与方法
2.1 动物
Wistar大鼠，体重150～200g，雌雄各半，购自安徽省医研所实验动物中心，合格证:皖医实动准字03号；C57BL6小鼠，3月龄，购自安徽医科大学实验动物中心，合格证：皖医实动准字01号。
2.2 药品及试剂
2.2.1 黄芪复方（浸膏）由合肥恒星药物研究所提供，用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）制成混悬液供灌胃（ig）给药。
2.2.2 地塞米松（DXM），四川巴中制药厂产品，批号990524，使用前用0.5%CMC-Na配成所需浓度。
2.2.3 卡介苗，药品生物制品检验所，批号980012，规格60mg/支。
2.2.4 SOD测定试剂盒，北京北方生物技术研究所产品。
2.2.5 ConA，LPS均为Sigma产品。
2.2.6 [3H]TdR，比放射活性为666TBq.mol－1，中国原子能原研究院产品。
2.2.7 RPMI1640培养粉为Gibco公司产品。
2.2.8 小牛血清，安徽医科大学微生物教研室提供。
2.2.9 牛血清白蛋白（BSA），Sigma公司产品。
2.3 仪器和设备
2.3.1 GL20A型全自动高速冷冻离心机，湖南仪器总厂离心机厂生产。
2.3.2 CX-7型全自动血液生化分析仪，美国Backman公司产品。
2.3.3 LBYN-6＋旋转式血液粘度仪，北京普利生集团公司产品。
2.3.4 Napco-6100型CO2培养箱，美国Precision Scientific公司产品。
2.3.5 FJ2107液体闪烁计数仪，西安262厂生产。
2.4 实验方法
Heymann肾炎模型的建立[3]：取大鼠60只，随机分为6组，即正常对照组、模型组；地塞米松（DXM）组；黄芪复方高、中、低剂量组（4、2、1g.生药/kg）。取卡介苗8支，置灭菌玛瑙钵中，加灭菌液体石蜡16ml，充分捻磨使之完全乳化，制成Freund's完全佐剂（浓度30mg.ml－1）备用。取肾皮质5g制成匀浆与弗氏完全佐剂混合成10ml，加生理盐水20ml，除正常对照组外，每鼠腹腔注射2ml，两周一次，自第4周大鼠蛋白尿明显出现起，灌胃给药，每日一次，连续四周。
2.5 观测指标
2.5.1 每日观察动物的一般情况，每周称体重一次，并以此来调整用药量。
2.5.2 尿蛋白的测定：采用磺柳酸比浊法作24小时尿蛋白定量，实验前测一次，实验开始后第1、2、3、4、6、7周各测一次。
2.5.3 血液生化测定：结束后24小时采血测定甘油三酯（TG）、总胆固醇（TCH）、极低密度脂蛋白（VLDL）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）。采用CX-7型全自动血液生化分析仪进行检测。
2.5.4 血浆丙二醛（MDA）含量的测定[4]：治疗停止后24小时采血，取血浆1ml，加入30%TCA1ml，摇匀后静置5min，加入0.67%TBA2ml，煮沸30min，冰水冷却。离心（2000rpm）10min，上清液于535nm处测吸光度值。
2.5.5 血清SOD活性测定：治疗停止后24小时采血，取血清测定SOD活性，采用放射免疫法，严格按试剂盒说明书操作。
2.5.6 脏器系数及病理组织学检查：实验结束时，取每鼠两侧肾脏、胸腺、脾脏称重。分别按g/100g体重各脏器系数（%）。取各组肾标本作HE染色，光镜检查。
2.5.7 大鼠脾淋巴细胞增殖反应：无菌取脾脏，常规制备脾细胞悬液（1×107.ml－1细胞）。在96孔培养板上，每孔加入脾细胞悬液100ul（终浓度为5×106ml－1）、ConA50ul（终浓度3ug.ml－1）或LPS50ul（终浓度6ug.ml－1）置37℃、5%CO2培养箱培养48h，终止前6h，每孔加入[3H]TdR1.4×104Bq，培养结束后收集细胞于69型纤维滤纸上，在液闪仪上测cpm值，结果以3个复孔cpm的均值表示。
2.5.8 IL-1的产生与检测
2.5.8.1 IL-1的产生：以RPMI-1640培养液常规制备大鼠腹腔巨噬细胞悬液（2×106.ml－1），在24孔培养板上，加入腹腔巨噬细胞悬液1ml置37℃、5%CO2培养箱培养2h后，吸弃培养液，以温Hank's液（37℃，含5%小牛血清）轻洗三次，除去非粘附细胞，获单层M￠，每孔分别加入内含LPS的RPMI-1640培养液1ml（终浓度6ug.ml－1）。置37℃、5%CO2培养箱培养6h后，去上清，以温Hank's 液轻洗一次，每孔加入RPMI-1640培养液1ml，置37℃，5%CO2培养箱继续培养42h后，4℃离心（2000rpm,10min），收集上清，即为含IL-1活性的上清液，待测。
2.5.8.2 IL-1的检测：用小鼠胸腺细胞增殖法检测IL-1，取正常C57BL6小鼠，无菌取胸腺，以RPMI-1640培养液制成2×107.ml－1细胞悬液，在96孔培养板上，每孔加入稀释30倍的IL-1待测上清100ul，每一样本设3个复孔，分别加入脾细胞悬液50ulCooA50ul（终浓度3ug.ml－1），置37℃、5%CO2培养箱内培养48小时，终止培养前6h，每孔加20ul[3H]TdR。培养结束后，用多头细胞收集器收集细胞于69型纤维滤纸上，在液闪仪上测定放射性，结果以3个复孔cpm的均值表示。
2.6 数据统计学处理：采用SPSS10.0进行统计，所有数据均用x±s表示。
3 实验结果
3.1 对动物一般状况及体重的影响：与正常对照组比较，模型组动物于造模一周左右出现毛发疏松，无光泽，精神萎靡，体重明显下降。黄芪复方三个剂量组的大鼠的体重均有不同程度的恢复，见表1。表1 黄芪复方对Heymann肾炎大鼠体重的影响（略）注：与正常组比较，△P＜0.05 ；与模型组比较，﹡P＜0.05。
3.2 对大鼠24小时尿蛋白的动态变化的影响：各组试验前24小时尿蛋白含量均＜24mg/24h。正常对照组在试验开始后第1、2、3、4、5、6、7wk尿蛋白与试验前均无显著性差异。模型组于开始建模后第一周末尿蛋白开始增加，其后逐周递增，第6周达峰值，DXM及黄芪复方各剂量组均明显降低，黄芪复方高剂量组的降尿蛋白作用尤为突出，见表2。表2 黄芪复方对Heymann肾炎大鼠24小时尿蛋白动态变化的影响（略）注：与正常组比较，△P＜0.01；与模型组比较﹡P＜0.05；﹡﹡P＜0.01。
3.3 对大鼠血清蛋白质、肾功能和血脂的影响：模型组大鼠血清TP和ALB均明显降低，TCH、TG、VLDL、BUN、Cr均明显升高，黄芪复方高、中剂量组能明显升高TP及ALB，明显降低TCH、TG、VLDL以及明显改善肾功能，使BUN、Cr降低，低剂量组可明显升高TP与降低TCH，对上述其他指标亦有一定改善，提示本药可改善Heymann肾炎大鼠的肾功能，并有降低血脂和升高血清蛋白质的作用，见表3。表3 黄芪复方对Heymann肾炎大鼠血清蛋白质、肾功能和血脂的影响（略D)注：与正常组比较，△P＜0.01；与模型组比较﹡P＜0.05，﹡﹡P＜0.01。
3.4 对大鼠血浆MDA含量和血清SOD活性的影响：与正常对照组比较，模型组大鼠血浆MDA含量明显升高，SOD活性明显下降，DXM及黄芪复方各剂量均能提高SOD活性和降低MDA含量，提示本药有明显抗氧化作用，见表4。表4 黄芪复方对Heymann肾炎大鼠血浆MDA含量与血清SOD活性的影响（略）注：与正常组比较，△P＜0.01，与模型组比较﹡P＜0.05，﹡﹡P＜0.01。
3.5 对大鼠免疫功能的影响：与正常对照组比较，模型组大鼠的胸腺及脾脏系数明显降低，大鼠脾淋巴细胞的ConA增殖反应明显降低，腹腔巨噬细胞产生IL-1明显增加，黄芪复方高、中剂量组能使降低的胸腺及脾脏系数恢复，黄芪复方高剂量组能使Heymann肾炎大鼠脾脏淋巴细胞ConA增殖反应恢复，使升高的IL-1水平明显降低。提示本方有明显的机能依赖性的免疫调节作用，见表5、表6。表5 黄芪复方对Heymann肾炎大鼠免疫器官脏器系数的影响(略)注：与正常组比较，△P＜0.05，与模型组比较，﹡P＜0.05。表6 黄芪复方对Heymann肾炎大鼠脾脏淋巴细胞ConA增殖反应和IL-1的影响（略） 10.581±2.102﹡
注：与正常组比较，△P＜0.01；与模型组比较，﹡P＜0.01。
3.6 对大鼠肾脏系数及其病理组织学改变的影响：模型组大鼠的肾脏系数明显增加，提示病变肾脏肿胀明显，黄芪复方高、中剂量组能明显降低肾脏系数，见表5。
病理组织学检查表明经HE染色，模型组大鼠的肾小球毛细血管壁明显增厚，部分肾小球系膜细胞和基质轻度增生，经PASM/Masson染色，可见肾小球毛细血管基底膜中心重度增生，肾近曲小管上皮细胞内可见多量脂滴，表明建模成功。黄芪复方中、高剂量组的上述病变均有不同程度的减轻，尤其是高剂量组经HE染色可见肾小球毛细血管壁轻度增厚；PASM/Masson染色，可见肾小球基底膜轻度增厚。提示本方对大鼠Heymann肾炎的肾病理组织学变化有明显的改善作用，见图1～8。
4 讨论
目前，我国的肾小球肾炎仍然是影响人们身体健康的重要原因之一，每年因肾小球肾炎而进入终末期肾衰的患者居各病因之首[5]。治疗肾小球肾炎通常使用糖皮质激素、免疫抑制剂、抗凝等药物，但对不同病理类型的肾炎其疗效尚不能令人满意，而且某些药物的不良反应亦难以避免。故开发治疗慢性肾炎的有效药物，将有广阔市场。
Heymann肾炎模型长期以来一直是用于研究人类膜性肾病的一个经典动物模型。因其发病迅速、病变稳定，可用来观察药物的疗效。制备该动物模型有主动型和被动型Heymann肾炎两种，主动型Heymann肾炎动物模型用自体或同种动物肾匀浆加完全弗氏佐剂给大鼠腹腔注射，两周一次，动物出现大量蛋白尿为其特征。
本研究采用了主动型Heymann肾炎，观察造模成功后给予黄芪复方对模型动物的影响。结果表明：①黄芪复方能明显改善Heymann肾炎模型鼠的肾脏病变，降低模型大鼠的肾脏系数，并明显改善其病理组织学变化，明显降低尿蛋白排泄量；②明显升高血清总蛋白、白蛋白水平；③改善肾功能，使升高的血清肌酐与尿素氮明显降低；④使血清SOD活性升高，MDA含量降低；⑤使对Heymann肾炎大鼠降低的胸腺和脾脏系数，以及脾淋巴细胞ConA增殖反应恢复，使腹腔巨噬细胞过高产生IL-1的水平明显降低。提示该方对Heymann肾炎模型有明显的疗效，其作用机制可能与黄芪复方具备抗氧化作用[6]，减轻氧自由基及脂质过氧化物对肾脏的损害，从而降低肾小球滤过膜通透性，从而减少尿蛋白；抗炎与免疫调节作用[7～9]，影响炎症因子的合成、释放，减轻肾脏的炎症反应；改善机体代谢，促进机体的恢复[10、11]等作用有关。
【】
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