子宫颈鳞癌组织中基质金属蛋白酶9表达的意义

         作者：孔灵玲，王学春，崔文，王旭，杨庆媛，宋希元，姜晓刚，燕春艳

【摘要】  目的：探讨基质金属蛋白酶MMP?9与宫颈鳞癌的发生、及转移的关系. 方法：免疫组化SP法测定MMP?9的表达及分布；明胶酶谱法测定活性型MMP?9蛋白的含量；RT?PCR技术检测MMP?9 mRNA表达水平. 结果：在宫颈鳞状上皮癌(SCC)组织和高度鳞状上皮内损害(HSIL)中MMP?9蛋白的表达量均高于低度鳞状上皮内损害(LSIL) (P<0.05)；宫颈SCC组织中淋巴结转移组MMP?9的阳性率为78.3%,高于无淋巴结转移组63.3% (P<0.01)；MMP?9的表达在不同的病理分级与临床分期之间差异无统计学意义. 而SCC和HSIL中的MMP?9酶活性均高于LSIL (P<0.01). 而SCC和HSIL中的MMP?9 mRNA的表达情况亦与上述结果相似. 结论：MMP?9与宫颈SCC的早期浸润及转移有关，MMP?9表达量的增高，尤其是其酶活性的增高有助于正确评估患者预后和制定适当的临床方案.

【关键词】  宫颈肿瘤; 鳞状细胞癌; 金属蛋白酶类; 肿瘤转移

      0引言

    宫颈癌发病率高，从低度鳞状上皮内损害(low?grade squamous intraepithelial lesions, LSIL)到高度鳞状上皮内损害(high?grade squamous intraepithelial lesions， HSIL)和原位癌(carcinomas in situ)，然后到鳞状上皮癌(squamous cell carcinomas，SCC)是一个连续的过程. 我们研究基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在宫颈癌的发生和发展过程中所起作用.

    1材料和方法

    1.1材料宫颈癌活检组织84例取自我院1999?01/2002?12宫颈癌患者，年龄25~68岁. 按国际妇产科联盟(FIGO) 1994年修订的临床分期标准，LSIL (CINI) 10例，HSIL (CINII, III) 21例，宫颈鳞癌53例. 在宫颈鳞癌中I期14例，II期39例；高分化11例，中分化17例，低分化25例；淋巴结转移23例. 手术时取肿瘤组织、癌旁组织、手术切缘及周围淋巴结. 抗MMP?9羊抗人多克隆抗体及SP免疫组化试剂盒（北京中山生物制剂公司）；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和明胶（美国Sigma公司）；Trizol试剂盒（美国GibcoBRL公司）；引物由上海生工生物工程公司合成.

    1.2方法

    1.2.1组织MMP?9表达免疫组化及结果判定  采用免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白?过氧化物酶法(SP法). 一抗的工作浓度为1∶100；阴性对照组以PBS代替一抗. 每个病例均同时做HE染色和MMP?9免疫组化. 结果判定［1］,以胞质或(和)胞膜出现棕黄色颗粒沉着为阳性表达. 先按染色强度打分：无色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；再按阳性细胞所占百分比打分：阳性细胞<5％为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75％为4分. 将染色程度和阳性细胞百分比的乘积进行评分：0～4分为(－)，5～8分为弱阳性(+)，9～12分为强阳性(?).

    1.2.2组织MMP?9活性分析标本于液氮下粉碎、匀浆、离心，取上清液以Centricon浓缩柱按体积比离心浓缩6倍，Bio?Rad蛋白定量试剂盒定量、分装.  取20 μL上清液进行聚丙烯酰胺(SDS)凝胶电泳，浓缩胶浓度50 g/L pH 6.8，分离胶浓度100 g/L pH 8.8. 电泳后，凝胶于50 mmol/L Tris?HCl （pH 7.0）, 5 mmol/L CaCl2, 100 mmol/L NaCl, 25 mL/L TritonX?100中浸泡振摇1 h，中间换液1次，不含TritonX?100的洗液洗5 min后，再用50 mmol/L Tris?HCl （pH 7.5）, 5 mmol/L CaCl2, 200 mmol/L NaCl, 0.2 g/L NaN3, 10 mL/L TritonX?100的孵育液37℃条件下孵育18～24 h，考马斯亮蓝R250染色，脱色，干燥封胶. 通过凝胶图像吸光度分析系统对结果进行灰度扫描，以平均吸光度（INT）和杂交信号面积（S）的乘积代表信号强度.

    1.2.3MMP?9 mRNA的表达按Trizol试剂盒说明提取组织总RNA，取上述RNA样品1.5 μg进行逆转录反应，反应体系为20 μL，反应条件为37℃ 1 h，95℃ 5 min. 取产物5 μL进行PCR扩增，MMP?9与内参照基因β?actin的引物共管扩增. MMP?9的引物序列为 5′?GGT CCC CCC ACT GCT GGC CCT TCT ACG GCC?3′及5′?GTC CTC AGG GCA CTG CAG GAT GTC ATA GGT?3′. β?actin引物序列为5′?CCG AAT TCA TCA TGT TTG AGA CCT TCA A?3′及5′?CC GGA TCC ATC TCT TGC TCG AAG TCC A?3′.  MMP?9及β?actin预计扩增片段分别为638 bp及326 bp. PCR参数为94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s. 30个循环后，72℃延伸5 min. 通过凝胶图像光密度分析系统对PCR产物电泳条带进行灰度扫描，以INT和S的乘积代表信号强度，MMP?9与β?actin灰度值的比值作为MMP?9 mRNA的相对表达量.

    统计学处理: 采用SPSS13.0软件分析系统进行非参数检验，以P<0.05为差异有统计学意义.

    2结果

    2.1MMP?9的免疫组化测定MMP?9在HSIL中的阳性率为47.6％，高于其在LSIL中的表达（vs 10%, P=0.043）; MMP?9在SCC中的阳性率为69.8%，高于其在HSIL和LSIL中的表达（P=0.021，P=0.001）. 宫颈癌组织中淋巴结转移组MMP?9的阳性率(78.3%)高于无淋巴结转移组(63.3%)，二者之间差异有统计学意义(P=0.008)；MMP?9表达在不同病理分级、临床分期之间差异无统计学意义(P=0.085和P=0.478). MMP?9的阳性表达主要定位于细胞质和细胞膜，染色阳性细胞不规则灶状分布，多位于癌巢基底部或癌巢周边的间质细胞，而癌巢中央较少表达；间质细胞主要表达于成纤维细胞、血管内皮细胞及血细胞(表1). 表1MMP?9表达与临床病理的关系

    2.2MMP?9活性分析明胶酶MMP?9的活性形式在底物聚丙烯酰胺(SDS)凝胶电泳中表现为浅蓝色背景下的透明条带. 采用非参数检验的检测结果显示，SCC组MMP?9的表达量高于HSIL及LSIL (P=0.000)； HSIL与LSIL间表达量比较差异有统计学意义(P=0.000, 表2).表2宫颈组织MMP?9活性及mRNA检测结

    2.3MMP?9 mRNA表达MMP?9在LSIL、HSIL和SCC中均有表达，采用非参数检验的检测结果显示,在SCC中的表达量高于在HSIL和LSIL中的表达量(P=0.008和P=0.001)；而HSIL与LSIL之间表达量比较差异有统计学意义(P=0.019,表2,图1).

    3讨论

    宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，占女性恶性肿瘤发病率的第2位. 其发生历经宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、原位癌、微小浸润癌及浸润癌的动态过程. 研究表明，肿瘤细胞侵袭转移的关键步骤之一是对ECM的降解，而MMPs是ECM降解及去除细胞迁移屏障的关键酶. MMPs对肿瘤侵袭和转移起重要作用，其中最重要的是 MMP?2和MMP?9. Davidson等［2］的研究证实，在宫颈癌细胞和癌旁间质细胞中MMP?2, MMP?9表达明显增强，显著高于正常上皮及CIN. Davidson等［3］的结果表明，正常宫颈上皮一般无MMP?9的表达，而MMP?9 mRNA及其蛋白产物在CINII, III和浸润癌中明显升高. Tamakoshi等［4］对多种妇科恶性肿瘤组织中的MMPs进行研究，认为MMP?9与宫颈癌关系最为密切. 宫颈癌的转移方式主要是淋巴结转移，临床上也是以有无淋巴结的转移来判断预后和指导临床. Iwata等 ［5］在研究中发现，MMP?9在有淋巴结转移的肿瘤中的表达高于非转移性肿瘤. Shue等［6］的结果证明高度鳞状上皮内损害(HSIL)和宫颈鳞癌MMP?2和MMP?9的阳性表达率均明显高于低度鳞状上皮内损害(LSIL)，而且与MMP?2相比，MMP?9的变化更加明显. 本结果显示，SCC和HSIL中MMP?9蛋白的表达量、酶活性以及mRNA的表达量均高于LSIL，提示MMP?9高表达是宫颈鳞状细胞癌发生、发展过程中的早期事件，MMP?9与宫颈癌的早期侵袭行为关系密切，可能成为判断早期宫颈癌预后的指标之一. 我们的结果还显示，淋巴结转移组的阳性率明显高于非淋巴结转移组，该结果表明MMP?9的高表达亦与肿瘤细胞浸润、转移的生物学行为有关. 因此检测MMP?9在宫颈癌中的表达情况有助于临床医师正确评估患者的预后并制定适当的临床治疗方案.

【】
  ［1］ Hao XP, Willis JE, Pretlow TG, et al. Loss of fragile histidine triad expression in colorectal carcinomas and premalignant lesions［J］. Cancer Res, 2000, 60(1): 18-21.

［2］ Davidson B, Goldberg I, Kopolovic J, et al. MMP?2 and TIMP?2 expression correlates with poor prognosis in cervical carcinomaa clinicopathologic study using immunohistochemistry and mRNA in situ hybridization［J］. Gynecol Oncol, 1999, 73(3): 372-382.

［3］ Davidson B, Goldberg I, Kopolovic J,et al. Expression of matrix metalloproteinase?9 in squamous cell carcinoma of the uterine cervix?clinicopathologic study using immunohistochemistry and mRNA in situ hybridization［J］. Gynecol Oncol, 1999, 72(3): 380-386.

［4］ Tamakoshi K, Kikkawa F, Nawa A, et al. Characterization of extracellular matrix?degrading proteinase and its inhibitor in gynecologic cancer tissues with clinically different metastatic form［J］. Cancer, 1995, 76(12): 2565-2571.

［5］ Iwata H, Kobayashi S, Iwase H, et al. Production of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in human breast carcinomas［J］. Jpn J Cancer Res, 1996, 87（6）：602-609.

［6］ Shue BC, Len HC, Hoh N, et al. Increased expression and activation of gelatinolytic matrix metalloproteinases is associated with the progression and recurrence of human cervical cancer［J］. Cancer Res, 2003, 63(19): 6537-6542.