微流控芯片电泳在尿蛋白分离中的应用

                     作者：褚少朋，王惠民，宋宏伟，丛辉，王跃国，张芹，张志泉，徐耀忠，金庆辉  

【摘要】  目的：将微流控芯片电泳用于临床尿蛋白分离的验证试验，评价其在临床上的应用价值。方法：用微流控芯片电泳对30例尿蛋白定性试验为阴性的对照组和70例尿蛋白定性在++以上的病例组进行检测，以白球蛋白的峰面积比值判断蛋白尿的选择性，并与美国Helena琼脂糖凝胶电泳结果比较。结果：30例对照组未检出蛋白峰，70例病例组除2例外均检出蛋白峰，其中选择性蛋白尿16例，非选择性蛋白尿50例，溢出性蛋白尿2例，与美国Helena琼脂糖凝胶电泳结果100%相符，与临床诊断符合率为97.14%。结论：该法用于临床尿蛋白分离的验证试验，效果很好，适于在中小普遍推广。

【关键词】  微流控芯片；电泳；尿蛋白；选择性蛋白尿

    [Abstract]   Objective: Micro fluidic chip electrophoresis was used for verifying test of separating clinical urine proteins and was evaluated in clinic. Methods:Thirty urine samples whose qualitative tests of urinary proteins were negative and seventy urine samples whose qualitative tests of urinary proteins were more than ++ were detected and the selectivity of proteinuria was judged by peak area ratio of albumin and globulin. The results were compared with American Helena agarose gel electrophoresis. Results:No protein peak was detected in thirty urine samples of the control gruop, but protein peaks were detected in seventy urine samples of the case group with the exception of two and among them 16 were selective proteinuria, 50 were nonselective proteinuria and 2 were overflow proteinuria. This assay achieved the same result as American Helena agarose gel electrophoresis and its accord rate in clinic was 97.14%. Conclusion: This technology used for verifying test of separating clinical urine proteins is very good. It provides strong proof for diagnosing and curing the clinical diseases. It is valuable to widely popularize this method to separate proteinuria in middle and small hospitals.

    [Key Words]   Micro fluidic chip; Electrophoresis; Urine proteins; Selectivity of proteinuria

　　尿蛋白增多可来源于多种疾病，尿蛋白电泳有助于病因诊断及病情严重程度判断。常用的尿蛋白电泳主要有醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。SDS-PAGE应用最为普遍，可分离出不同分子量的蛋白质，但该法操作极为繁琐，花费时间较长。近年来国外把毛细管电泳(CE)[1]用于分离尿蛋白，虽操作简便、快速，但需要昂贵的仪器，限制了临床的广泛推广。近几年起来的微流控芯片技术[2]具有高效、快速、试样用量少、散热能力强等优点。并可实现阵列并行操作,用于无机分子、有机分子、生物大分子(如DNA、氨基酸、蛋白质、细胞)、细菌及病毒等的分析检测已有较多研究报道，但鲜见在临床上用于分离尿蛋白的报道，我们自行研制了微流控电泳芯片，并用于分离临床尿蛋白的验证试验，效果很好，与美国Helena琼脂糖凝胶电泳结果100%相符，与临床诊断符合率为97.14%。

    1   材料与方法

    1.1   对象   (1)病例组：上海第二军医大学附属长征医院住院患者70例中,男40例，女30例, 年龄24～89岁。其中尿毒症14例，慢性肾炎21例，慢性肾衰4例，肾病综合症2例，多发伤2例，糖尿病等27例。留取尿蛋白定性在++以上的晨尿标本70份。（2）对照组：健康人晨尿标本30份，无肾脏病史及其他慢性病史，尿蛋白定性试验为阴性。

    1.2   试剂与仪器   （1）试剂：纯人白蛋白、人运铁蛋白、人IgG购自美国Sigma公司，SP 300 plate琼脂糖凝胶电泳试剂盒购自美国Helena公司。75mmol/L硼酸盐(pH 10.55)含0.8mmol/L乳酸钙、1%(v/v)乙胺电泳缓冲液用双蒸水配制，使用前经0.2μm滤膜过滤，并真空抽气。（2）仪器：REP全自动电泳仪，美国Helena公司。自制微流控芯片：整个石英芯片尺寸为64mm×32mm，芯片微管道宽约70μm，深约40μm，芯片进样池到十字交叉点长4mm，有效分离长度为42mm，储液池直径为2.5mm。电泳仪与检测系统为中科院微系统与信息技术研究所自制[3,4]，该系统可调输出电压为0～5000V，利用214nm紫外检测器检测蛋白浓度，软件为自行设计。

    1.3   方法

    1.3.1   尿标本预处理   取尿样5ml置分子量为7000透析袋中，于1L 75mmol/L pH 10.3硼酸盐缓冲液中透析1小时，于聚乙二醇20000中浓缩至干，用0.5ml双蒸水洗出，磺基水杨酸-硫酸钠比浊法测定蛋白质含量。

    1.3.2   电泳与检测   新制芯片分别用1mol/L NaOH、双蒸水、电泳缓冲液浸泡30min。每次电泳前分别用1mol/L NaOH、双蒸水、电泳缓冲液冲洗芯片管道1min并使电泳缓冲液充满进样与分离管道，在样品池加4μl待测尿蛋白样品。进样时，进样管道两端加500V电压，分离管道两端悬空，进样15s。分离时进样管道两端悬空，分离管道两端加1500V电压，电泳4min。仪器在214nm自动记录蛋白区带信号，并对时间描出电泳图谱。

    1.3.3   Helena琼脂糖凝胶电泳   从SP 300 plate琼脂糖凝胶电泳试剂盒中取出胶片置于电泳槽上，点尿样3μl，在21℃、350V条件下电泳8min，然后在60℃烘干11min。取出胶片置于染色槽内染色、 脱色、 透明、 凉干后在525nm扫描，仪器自动描出电泳图谱。

    1.3.4   判断蛋白尿的选择性   分别白蛋白、球蛋白的峰面积，以白球蛋白的峰面积之比判断蛋白尿的选择性，如比值大于5，则为选择性蛋白尿；反之则为非选择性蛋白尿。

    2   结     果

    2.1   微流控芯片电泳成份分辨力   取4μl (纯人白蛋白、人运铁蛋白、人IgG各4g/L)3种标准蛋白混合溶液放在微流控芯片中进行检测。如图1所示，3种标准蛋白获得基线分离，人IgG首先出峰，人运铁蛋白其次，人白蛋白最后出峰。

    2.2   微流控芯片电泳重复性   将浓度均为5.0g/L的纯人白蛋白与人运铁蛋白标准溶液严格按照实验方法分别平行操作5次，重复性良好。纯人白蛋白和人运铁蛋白迁移时间的相对标准偏差(RSD)分别为2.68%和2.24%；峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为5.85%和4.96%。图2为微流控芯片电泳重复性谱图。

    2.3   微流控芯片电泳回归方程、线性范围及检出限 配制一系列不同浓度的标准溶液，采用外标法以峰面积定量，试验纯人白蛋白和人运铁蛋白的线性范围，得出其线性回归方程，其中x为浓度，y为峰面积。并以噪声峰高3倍值对应的浓度估算了检出限，所得结果见表1。

    2.4   微流控芯片电泳临床样本测定   对照组样本30例未检出蛋白峰；病例组样本70例中选择性蛋白尿16例，非选择性蛋白尿50例，溢出性蛋白尿2例，均为多发性骨髓瘤患者。未能检出蛋白峰，即假性蛋白尿2例，与临床疾病符合率为97.14%。与Helena琼脂糖凝胶电泳进行对比，获得一致结果。图3为临床患者尿液蛋白微流控芯片电泳图谱及琼脂糖平板凝胶电泳结果灰度扫描图。

    3   讨      论

    微全分析系统(Micro total analysis systems，μTAS)是上世纪90年代在分析化学领域起来的多学科交叉的新的研究方向。它以微机械系统（microelectromechanical systems, MEMS）为基础，以生命为主要研究对象，以在不同材料的基片上设计并加工出适合生化分析的各种微管道为手段。μTAS的最终目标是实现生化分析实验室的“个人化”、“家庭化”、“便携化”，发展成为一种以芯片为平台，集成进样、样品处理、生化反应、分离、检测为一体的全功能微型检测及分析系统。

    基于MEMS技术制作的微流控芯片是微全分析系统中发展相对成熟的一个分支。微流控芯片具有良好的散热性，可外加比常规毛细管电泳更高的电场，实现样品的快速高效分离。1992年瑞士科学家Manz等首次报道了微芯片毛细管电泳这种分离分析技术，展示了微全分析系统的雏形和优势，该项技术在后来的研究中得到了极大的发展和应用。1996年Mathies和Northrup合作，将聚合酶链式反应与毛细管电泳集成，首次实现了聚合酶链反应和毛细管电泳在一块芯片上同时完成。作为一门交叉学科，微流控芯片已成为当今生命科学、化学、微机械和微电子学领域的研究热点，其在疾病诊断方面的应用尤其受到人们的关注。

    本文利用微流控芯片电泳检测临床尿蛋白获得良好效果，尿样本经适当透析处理后，可依据尿中蛋白分子量与电荷的不同而进行电泳分离，尿中维生素C、肌酐等物质均不影响分析结果。微流控芯片尿蛋白电泳结果与临床诊断符合率98%，有2例患者经查寻病史无肾脏及泌尿系统病变，而经韩国东盈尿常规化学检测尿蛋白为阳性，但标本经美国Helena全自动电泳仪琼脂糖电泳以及微流控芯片尿蛋白电泳均为阴性。这2例标本1例为黄胆标本，另1例为碱性尿标本，其pH为8.5，由于韩国东盈尿常规化学检测尿蛋白采用pH误差原理，而造成假阳性结果。

    从图3中可以看出凝胶电泳灰度扫描图蛋白峰位置与微流控芯片电泳结果正好相反，这主要是由于二者电泳原理不同而造成的。微流控芯片电泳主要以电渗流作为蛋白区带的驱动力。玻璃或石英芯片在中性或碱性pH下，其表面带负电荷，液流中与其相邻的部分形成沿通道壁的带正电荷的界面。在通道二端施加高电压，带正电荷的界面在电场作用下产生迁移，继而带动通道内界面包裹的液流产生电渗流，使液体向负极移动。在碱性条件下蛋白质虽带负电荷，因电渗流的力大于电荷作用力，蛋白质分子亦向负极泳动，与普通区带电泳相反，带负电荷越多的蛋白质分子泳动越慢[5]。而凝胶电泳即是普通区带电泳，是依据电泳速度不同实现分离，带负电荷越多的蛋白质分子泳动越快。

    1960年Blainly等[6]首先提出了蛋白尿选择性的概念作为判断肾小球损伤严重程度的指标。判断这种能力可通过电泳测定尿液中的中分子量蛋白质和高分子量蛋白质的比值来确定。肾小球疾病时，滤过膜的通透性和滤过作用都发生改变，当肾小球疾病较轻，滤过膜“漏洞”较小时，尿中以中分子量的蛋白为主，而大分子量蛋白排出很少，称为选择性蛋白尿。当肾小球病变明显，滤过膜“漏洞”较大时，尿中不仅有大量的白蛋白，而且有多量的大分子蛋白(如球蛋白)，则称为非选择性蛋白尿。选择性蛋白尿测定的结果可推测病理类型，预测反应及估计预后。小儿肾病综合征中蛋白尿呈高选择性，其中约有97%患者为微小病变型肾病，在成人亦多数为微小病变或轻微病变，但也可见于膜性肾小球肾炎、局灶性肾小球肾炎、增殖性肾炎。凡高选择性者可预测对激素及免疫抑制剂治疗反应良好；选择性高者预后较好，反之预后差。在本次试验中，共对70例临床尿蛋白阳性标本进行了电泳，有助于判断尿中蛋白质的来源，从而为临床疾病的诊断及治疗提供强有力的佐证。

    本法分离效果类比于醋酸纤维素薄膜电泳或琼脂糖电泳，具有快速简便、有良好的重复性、测定费用低廉等特点，适于在中小普遍推广。

【】
  [1] Wittke S, Fliser D, Haubitz M, et al. Determination of peptides and proteins in human urine with capillary electrophoresis–mass spectrometry, a suitable tool for the establishment of new diagnostic marker[J]. J Chromatogr A, 2003, 1013(1-2) : 173－181.

[2] 于建群, 王立鼎, 刘军山. 集成毛细管电泳芯片的结构及其制作技术研究进展[J]. 机械工程, 2003, 14(2) : 168－175.

[3] 徐良基, 贾春平, 金庆辉, 等. 基于微流控芯片的一种蛋白检测方法[J]. 功能材料与器件学报, 2005, 11(1) : 117－121.

[4] 刘 菁, 庄贵生, 徐良基, 等. 微芯片电泳—紫外检测系统分析蛋白质[J]. 生物化学与生物物理进展, 2004, 31(11) : 1045－1049.

[5] 王惠民, 孙承龙, 王跃国, 等. 微流控芯片电泳在快速分离尿蛋白中的临床应用价值[J].中华检验医学杂志, 2004, 27(9) : 551－554.

[6] 熊立凡,主编. 临床检验基础[M]. 第3版. 北京: 人民卫生出版社, 2003：122.