HPLC-ELSD测定补益蒺藜片中黄芪甲苷的含量

                 作者：杨庆胜，李彩荣，赵雪晖

摘 要: 目的: 建立补益蒺藜片中黄芪甲苷的含量测定方法。 方法: 采用高效液相―蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD），对补益蒺藜片中黄芪甲苷进行含量测定。色谱柱为ODS-C 18 色谱柱（250mm×4.6mm，20μm）;流动相:乙腈―水（1∶2）;进样量10μL;室温;流速1.0mL/min;ELSD参数:漂移管温度100℃，气体流速2.74mL/min。 结果: 黄芪甲苷对照品在2.024～10.120μg范围内，进样量与峰面积间呈良好的线性关系，r=0.9996，平均回收率为99.26%。 结论: 本方法操作简便，结果准确，重现性好，可用于控制该制剂的质量。

    关键词: 补益蒺藜片;黄芪甲苷;高效液相―蒸发光散射检测法;含量测定

    补益蒺藜片系部颁标准补益蒺藜丸剂改品种，是由黄芪（蜜炙）、白术（麸炒）、山药、茯苓、白扁豆、芡实（麸炒）、当归、沙苑子、菟丝子、陈皮等十味中药经工艺加工制成的薄膜衣片，具有健脾补肾、益气明目之功能，用于脾肾不足、眼目昏花、视物不清、腰酸气短等症 〔1〕 。黄芪是该处方中的君药，因此，黄芪甲苷是补益蒺藜片的活性成分之一。为了控制补益蒺藜片的质量，保证其疗效，我们采用高效液相―蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）测定了黄芪甲苷在该制剂中的含量，并对其测定方法进行了研究。

　　 1 仪器与试剂

    仪器:高效液相色谱仪（美国Agilent1100型， Agilent化学工作站提供）;ODS-C 18 色谱柱（250mm×4.6mm，20μm，大连依利特）;All-tech500型蒸发光散射检测器;HGA-2000空气发生器。

    对照品:黄芪甲苷（药品生物制品检定所提供），批号:0781-200307，供含量测定用。样品:补益蒺藜片三批，报产品时自制。   试剂:乙腈为色谱纯（天津四友公司生产），其他试剂为分析纯;水为重蒸馏水（自制）。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件

    色谱柱为ODS-C 18 色谱柱（250mm×4.6mm，20μm）;流动相:乙腈―水（1∶2）;进样量10μL;室温;流速1.0mL/min;ELSD参数:漂移管温度100℃，气体流速2.74mL/min。

    2.2 供试品溶液制备

    取补益蒺藜片适量，去除薄膜衣，研碎，取细粉约2.0g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇100mL，热回流提取6h，提取液回收甲醇并浓缩至干，残渣加水15mL微热溶解，加乙醚振摇提取2次，每次20mL，弃去醚层，再用水饱和正丁醇振摇提取3次，每次20mL，合并正丁醇液，用氨试液提取2次，每次20mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5mL，使溶解，放冷，通过D101大孔树脂柱（1.5cm×12cm），以水50mL洗脱，弃去水液，再以70%乙醇100mL洗脱，收集70%乙醇洗脱液，蒸干，用甲醇溶解，并定容至2mL量瓶中，经0.45μm微孔滤膜过滤后，作为供试品溶液。

　　 2.3 线性关系考察

    精密称取黄芪甲苷对照品5.06mg，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得0.506mg/mL的对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液4μL、8μL、12μL、16μL、20μL，按HPLC条件进样分析。以进样量（X）对峰面积（Y）作图，得到其标准曲线图。其回归方程Y=2.94×10 -7 X+0.02748，r=0.9996，n=5。黄芪甲苷对照品在 2.024～10.120μg范围内，进样量与峰面积间呈良好的线性关系。

　　 2.4 精密度试验

    准确吸取上述对照品溶液10.0μL，注入液相色谱仪，测定峰面积值，重复进样6次，RSD=1.03%，n=6。结果表明，本法精密度较好。

　　 2.5 稳定性试验

    取同一供试品溶液，分别于0h、1h、2h、4h、6h、8h测定黄芪甲苷的峰面积值.结果:RSD=0.78%，n=6。可知供试品溶液在8h内稳定。

　　 2.6 重复性试验

    对同一批样品平行制备5份供试液，分别取10.0μL，注入液相色谱仪，进行含量测定，RSD=1.96%，n=5。表明本法重现性较好。

　　 2.7 阴性对照试验

    取不含黄芪（蜜炙）的上述处方药材，按工艺制备制成缺黄芪（蜜炙）的阴性制剂，按供试品溶液制备方法制成阴性溶液，分别吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性溶液各10.0μL，注入液相色谱仪，按上述条件进行测定，记录色谱图。从色谱图中可以看出，方中其他成分在本测定条件下，对黄芪甲苷的含量测定无干扰。见图1、图2、图3。 图1 对照品色谱图  图2 样品色谱图 图3 阴性样品色谱图

    2.8 加样回收率试验

    分别取已知含量为0.662mg/g的样品5份，每份约1.0g，均精密称定，分别加入黄芪甲苷对 照品溶液1mL（浓度0.506mg/mL），按供试品溶液的制备方法，分别吸取供试品液各10.0μL，按照上述色谱条件，测定黄芪甲苷的含量，加样回收率，结果见表1。结果表明，本测定方法回收率良好。 表1  加样回收率试验结果表2  三批样品中黄芪甲苷含量测定结果 样品批号 含量（mg/g） RSD（%）031107 0.662 0.55031116 0.721 0.97031122 0.586 0.72

    3 讨论

    补益蒺藜片中黄芪甲苷含量测定方法已报道有薄层扫描法 〔2〕 、比色法 〔3〕 、HPLC法 〔4〕 、HPLC-ELSD法 〔5〕 。我们在实际工作中发现，由于复方中药制剂组分复杂，用薄层扫描法、比色法测定受实验条件的影响较大，重现性也较差;且用HPLC法低波长紫外检测时，溶剂背景难以消除。本实验采用高效液相色谱―蒸发光散射检测，不受流动相溶剂的干扰，对黄芪甲苷类等具有紫外末端吸收的物质，检测效果良好，可作为该制剂的含量测定方法。

    笔者在供试品溶液制备时，考察了不同种溶媒甲醇、乙醇及水提取。结果显示甲醇的提取率较高，而且提取的杂质较少。因此，以甲醇提取为最佳选择。我们曾用了3种不同提取方法:索氏提取器提取、加热回流提取、超声波提取。结果表明，后两种提取方法提取黄芪甲苷不完全，测得含量低，故本实验采用索氏提取器提取。

    曾试验了甲醇―水（40∶60），四氢呋喃―水（25∶75）及乙腈―水（1∶2）、（2∶3）等不同流动相，考察黄芪中各成分的分离情况及检测灵敏度。结果表明，采用乙腈―水（1∶2）为流动相时，分离情况良好，且出峰保留时间适度。

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    〔1〕中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第一册［S］.1989.92.

    〔2〕鲁静，王宝琴.黄芪甲苷的薄层扫描法测定［J］.中成 药，1992，14（6）:34.

    〔3〕陆一心.黄芪甲苷定量方法的研究［J］.中成药，1996， 18（2）:38.

    〔4〕付铁军，李伯刚，及元乔，等.高效液相色谱法测定黄芪注射液中黄芪甲苷的含量［J］.天然产物的研究与开发，1997，9（4）:53.

    〔5〕周春玲，鲁静.高效液相色谱―蒸发光散射检测测定黄芪中黄芪甲苷的含量［J］.中药杂志，2000，25（3）:66.