“咳喘宁”贴膏皮肤用药毒性实验研究
作者：王晶，关东升，陈淑彦，司小兵
摘 要：目的：探讨“咳喘宁”贴膏皮肤用药的安全性。方法：通过对健康家兔皮肤急性毒性试验、健康豚鼠皮肤刺激性试验及皮肤过敏性试验，观察“咳喘宁”贴膏对动物经皮肤用药的急毒、刺激和过敏性。结果：“咳喘宁”贴膏对家兔完整皮肤和破损皮肤未引起急性毒性反应；对豚鼠完整皮肤和破损皮肤有轻度刺激性，但给药后48 h，这种刺激性消失；对豚鼠完整皮肤无致敏作用。结论：“咳喘宁”贴膏临床用药安全、无毒。关键词：“咳喘宁”贴膏；急性毒性；皮肤刺激性；皮肤过敏性
“咳喘宁”贴膏是甘肃中医学院刘世琼教授经过多年临床验证，并结合药理研究，反复筛选研制而成的纯中药外用穴位贴剂。其应用简单、，多年来常在“三伏天”用于支气管哮喘和慢性支气管炎，疗效十分肯定。为研究其用药的安全性，本实验进行了“咳喘宁”贴膏皮肤用药的动物毒性实验研究，并为本产品的开发提供理论依据。
1 材料
1.1 实验动物
健康成年家兔12只，雌雄各半，体重2.0±0.5 kg（兰州生物制品研究所动物实验室提供，合格证号：医动字第14-004号）；健康成年豚鼠36只，雌雄各半，体重300±50 g〔农业院兰州兽医研究所动物实验室提供，合格证号SCXK（甘）2004-0005〕。
1.2 实验药品
“咳喘宁”贴膏（由白芥子、甘遂、延胡索、苏子、生姜汁等组成），空白纱胶贴剂（有三层纱布和一层无刺激性胶布组成），以上两种受试物规格为：皮肤急性毒性试验为7 cm×10 cm，皮肤刺激性试验为4 cm×5 cm，皮肤过敏试验为3 cm×3 cm，均由“咳喘宁”贴膏课题组提供；2，4―二硝基氯代苯（上海试剂一厂，批号001201），分析纯硫化纳（莱阳化工实验厂，批号20040909）。
2 方法和结果
2.1 “咳喘宁”贴膏的皮肤急性毒性试验
2.1.1 试验方法
动物分组：将12只家兔，按随机数字表法分为3组，每组4只，雌雄各半。A组（大剂量药物贴剂组，即贴敷A组，为临床用药药量的6倍）；B组（小剂量药物贴剂组，即贴敷B组，为临床用药药量的3倍）；C组（空白纱胶贴剂对照组）。
操作方法：按〔1〕方法，用3份硫化钠，1份皂粉，7份淀粉，加水配成糊状软膏，将家兔右侧背部脱毛70 cm2而不受伤， 24 h后，用75%乙醇消毒。按文献〔2-3〕方法，A组于脱毛处敷贴“咳喘宁”贴膏（含生药量4 g），8 h后去掉，每天1次，共贴6次；B组于脱毛处敷贴“咳喘宁”贴膏（含生药量4 g），6 h后去掉，隔天1次，共贴4次；C组脱毛处敷贴滴4 mL生理盐水的空白纱胶贴剂。然后轻轻按压2次，再用不干胶布固定，分笼饲养。末次除去受试物后，用温水除去残留受试物，于去掉受试物1、24、48、72 h至7 d，每日观察动物的体重、皮肤毛发、饮食、二便、呼吸、眼和黏膜的变化、精神状态、四肢活动及死亡情况。如果对完整皮肤无毒性反应，则在家兔左侧背部脱毛70 cm2，24 h后，用碘伏和75%乙醇消毒皮肤，再用消毒处理的400号细砂纸在脱毛处造成擦伤，使皮肤出现密集出血点，以渗血为度，立即在擦伤部位敷贴受试物。具体方法及观察指标同上，并进行三组的对照比较。如遇死亡，应及时进行尸检和肉眼观察，当肉眼可见病变时，应进行病理组织学检查。
2.1.2 结果
〖HT]“咳喘宁”贴膏高低剂量应用后，完整皮肤及破损皮肤家兔皮毛光泽正常，对家兔的饮食、二便、呼吸、眼和黏膜变化，精神状态，四肢活动均未造成任何影响，破损皮肤均在给药后第2 d出现点状血痂，第7 d内脱痂痊愈。在观察期14 d内未出现急性毒性反应，无一只家兔死亡。与对照组体重比较，结果见表1。表 “咳喘宁”贴膏对皮肤急性毒性试验家兔体重的影响 表1显示:A、B组与C组比较无显著性差异(P＞0.05)，说明本药对家兔体重无影响。
2.2 “咳喘宁”贴膏的皮肤刺激性试验〔4-5〕
2.2.1 试验方法
动物分组：将12只豚鼠按随机数字表法随机分为A组（完整皮肤组）、B组（破损皮肤组）2组，每组6只，雌雄各半。
操作方法：按文献〔1〕方法，于给药前24 h将豚鼠脊柱两侧对称脱毛2块而不损伤皮肤，每块去毛面积约4 cm×5 cm（约相当于豚鼠体表面积的10 %），具体操作方法同皮肤急性毒性试验脱毛法。
给药采用左右侧自身对照。A组用75%乙醇消毒后，左侧脱毛处敷贴“咳喘宁”贴膏（含生药量4 g），右侧敷贴滴生理盐水4 mL的空白纱胶贴剂，8 h后去掉，每天1次，连续给药6 d。B组用碘伏、75%乙醇消毒皮肤，再用消毒处理的400号细纱纸在脱毛处造成擦伤，使皮肤出现密集出血点，以渗血为度，立即在擦伤部位敷贴受试物，具体方法同A组（完整皮肤组），每天1次，连续给药6 d。末次敷贴受试物后，用温水除去残留受试物，分别于去掉受试物后1、24、48、72 h观察涂抹部位有无红斑和水肿情况，是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄。按文献〔6〕中“皮肤刺激性反应评分标准”每日进行刺激反应评分，记录各组每日的评分值，刺激指数平均值:刺激指数平均值=（红斑形成总分+水肿形成总分）/动物总数，按文献〔6〕中“皮肤刺激强度评价标准”评价皮肤刺激强度。
2.2.2 试验结果
见表2。经过观察发现，豚鼠完整皮肤组与破损皮损组敷贴“咳喘宁”贴膏后1 h，豚鼠皮肤用药部位有不明显红斑，个别出现明显红斑，无水肿，刺激强度为轻度刺激性，但以上皮肤改变在去除药物后48 h内逐渐消失，各组自身对照部位均无红斑、水肿出现，刺激强度小于0.5〔6〕，为无刺激性反应。两组皮肤均无色素沉着、出血点、粗糙和菲薄情况，损伤皮肤组动物皮肤有点状血痂，至48 h开始脱落，给药区与其自身对照区无明显差异（P＞0.05），故血痂是擦伤所致，非药物引起，且破损皮肤组动物皮肤光泽程度、弹性与完整皮肤组无显著差异。表2 “咳喘宁”贴膏对豚鼠皮肤的刺激试验 注：A无刺激性; B轻度刺激性
2.3 “咳喘宁”贴膏的皮肤过敏试验 〔3，7〕
皮肤过敏试验是通过动物重复接触受试物后，观察机体免疫系统在皮肤上的反应。是应用受试物后产生免疫学传递的一种皮肤反应。在动物首次接触供试品一段时间后，再次进行供试品的激发接触，可观察动物是否已出现过敏状态，然后再通过观察激发接触后的反应来判定受试动物有无发生过敏反应。
2.3.1 试验方法
动物分组：将24只豚鼠按随机数字表法随机分为3组，即A组：阴性对照组（生理盐水）；B组：药物贴剂组（“咳喘宁”贴膏）；C组：阳性对照组［用分析纯丙酮临用前配制成1%的致敏浓度和0.1%的激发浓度，即阳性致敏物为1% 2，4―二硝基氯代苯（DNCB），阳性激发物为0.1% DNCB］。每组8只，雌雄各半。
操作方法：
(1）致敏接触：给药前24 h，将健康豚鼠背部脊柱左侧按〔1〕方法脱毛，具体操作方法同皮肤急性毒性试验脱毛法，脱毛区为3 cm×3 cm。用温水洗净豚鼠背部脊柱左侧皮肤后，A组左侧脱毛区敷贴滴0.2 mL生理盐水的空白纱胶贴剂；B组左侧脱毛区敷贴“咳喘宁”贴膏（含生药量0.2 g）；C组左侧脱毛区敷贴滴1% DNCB 0.2 mL空白纱胶贴剂。三组受试物均贴敷6 h，试验第7 d和第14 d以同样方法各重复1次，共计3次。
(2）激发接触：于激发接触敷贴前24 h，再次在右侧对称部位脱毛3 cm×3 cm,具体方法同上。于致敏接触末次给药后14 d（第28 d）在各组动物背部右侧脱毛区，A组敷贴滴0.2 mL生理盐水的空白纱胶贴剂;B组敷贴“咳喘宁”贴膏（含生药量0.2 g）;C组敷贴滴0.1% DNCB 0.2 mL空白纱胶贴剂固定，三组均贴敷6 h后，去除并用温水洗净受试物，即刻观察。然后于24、48、72 h再次观察皮肤过敏反应情况，按文献〔6〕中“皮肤过敏反应程度的评分标准”给予评分，各组各时间平均分值，以反映受试物的致敏强度，同时观察豚鼠是否有站立不稳、休克等全身过敏反应，按公式计算致敏反应发生率：致敏反应发生率=有过敏反应动物数（无论程度轻重）/动物总数×100%，按文献〔6〕中“皮肤致敏性评价标准”依据致敏反应发生率评价致敏性。
2.3.2 试验结果
结果见表3。表3“咳喘宁”贴膏对豚鼠皮肤过敏反应分值及评价 药物贴剂组与阴性对照组致敏激发接触后观察，即刻至72 h激发接触部位均未出现红斑及水肿，致敏率为0，阳性对照组自激发给药6 h后，即刻观察该组8只豚鼠皮肤：2只出现明显红斑为2×2分，其中1只伴勉强水肿为1×1分；6只出现严重红斑为3×6分，其中1只伴皮肤隆起约1mm水肿为3×1分，其中3只伴勉强水肿为1×3分，总积分29分，24 h开始消退总积分为20分，48 h总积分15分，72 h后可见红斑及水肿，总积分为10分，致敏率100 %。与A、B组比较，有明显差异，表明“咳喘宁”贴膏对豚鼠皮肤无致敏作用。
3 结论
支气管哮喘及慢性支气管炎是临床上常见又难治的呼吸道疾病，无论中医西医目前对其都缺乏理想的方法。“咳喘宁”贴膏是经导师多年临床验证，并结合药理研究，反复筛选研制而成的用于治疗支气管哮喘及慢性支气管炎行之有效的外用穴位贴剂。本贴剂敷贴于穴位表面，一是通过透皮吸收而发挥药物本身的治疗作用；二是通过对相关经络腧穴的刺激而发挥经络系统的调整作用；三是该药贴多年来常在“三伏天”使用，能起到“时间疗法”作用，三重治疗而达到健脾益肾、降气平喘、化痰止咳的综合治疗作用，更加有效地促使病愈。“咳喘宁”贴膏免疫学实验〔8〕也表明，该贴剂能提高机体的免疫功能，有较好的化痰平喘作用。
本实验结果表明：“咳喘宁”贴膏不论外用于家兔完整皮肤，还是破损皮肤均无急性毒性；外用于豚鼠完整皮肤，特别是破损皮肤有轻度刺激性，但给药后48 h内可自行消失，其试验使用剂量是临床用药药量的6倍，且由于“咳喘宁”贴膏在临床应用时不是反复在同一穴位贴敷，故不影响药物治疗的连续性；外用于豚鼠皮肤无过敏反应。从毒方面说明“咳喘宁”贴膏穴位贴敷治疗支气管哮喘和慢性支气管炎是安全的外用制剂，值得临床推广应用及开发新产品。
由于本处方不含毒性药物，故按文献〔6〕要求无需进行长期毒性试验。
文献：
〔1〕郝光荣.实验动物学[M].第2版.上海：第二军医大学出版社，2002：184-185.
〔2〕谢秀琼.中药新制剂开发与应用[M].北京：人民卫出生版社，2002：565-570.
〔3〕钱芳，杨戒骄，杜琪,等.伤疡愈软膏皮肤毒性实验研究[J].药房, 2004, 15（7）：405-406.
〔4〕陈奇.中药药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社，1996:164-167.
〔5〕韦京辰，徐庆，唐祖年.乳癖贴皮肤毒性实验研究[J].华夏医学, 2004, 17（1）：19-20.
〔6〕中华人民共和国卫生部药政局.中药新药研究指南（药学、药理学、毒理学）[M].北京：人民卫生出版社,1994:209-212.
〔7〕王玉芬，韩双红.止痛涂膜药理作用研究[J].河北中医,2002,24（5）：394-397.
〔8〕刘世琼，张全爱.咳喘灵贴膏贴敷穴位治疗豚鼠哮喘的实验研究[J].中医药学刊,2004,22（4）：620-621.
