利用尿素酶试验测定结核分支杆菌耐药性的方法学研究

               作者：武延隽 赵中夫 明 亮 刘明社 李水仙 薄红霞  

【摘要】  目的：利用尿素酶试验的方法对结核分枝杆菌的耐药性进行检测。方法：采用液体结核分枝杆菌的培养基加尿素和酚红指示剂，高压消毒灭菌，将分离纯培养的结核分枝杆菌接种其中, 再加入不同浓度的抗结核分枝杆菌的药物培养，分别设阳性和阴性对照。待阴、阳性对照结果完全清晰时，终止培养，观测结果。结果：结核分枝杆菌、在500 cfu/mL以上时，结果在3 d～7 d内显现;在500条以内时,其结果在培养7 d～10 d内显现；阳性菌株中，通过加温处死，其尿素酶试验均为阴性；与传统的绝对浓度法比较，差异无显著性（χ２=2.25，P＞0.10）。结论：尿素酶试验方法快速、简便，将对结核分枝杆菌耐药性检测提供一种新方法。

【关键词】  结核分支杆菌；尿素酶；耐药性

    Abstract  Objective:To determinate drug resistance of tubercle bacillus by employing urease test．Methods: The observed purified mycobacterium were inoculated into the specific autoclaved fluid mycobacterium medium with urea and Phenol Red, and incubated with different concentration of anti-tubercle bacillus drugs until the corresponding negative and positive results became apparent．Results: The results became apparent at 3 to 7 days when mount of the incubated mycobacterium is more than 500 cfu/mL, and 7 to 10 days when mount is less than 500 cfu/ml. To avoid the fake positive samples, the positive mycobacteriums were heating-killed and all tested as negative by urease test．Compared with traditional absolute concentration method, urease test method had no statistic differences (χ２=2.25，P＞0.05)。Conclusion: Urease　testing is a convenient and rapid method to inspect drug resistance of mycobacterium tuberculosis.

    Key words  Mycobacterium  tuberculosis；Urease；Drug resistance

    尿素酶是一种胞外酶，多数细菌含有该酶，可分解尿素，使环境变碱，所以，常用尿素酶试验来进行细菌的鉴定。分枝杆菌多数菌种含有尿素酶，如结核分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、胃分枝杆菌均为阳性。而这些分枝杆菌是临床结核病的主要病原体。

    尿素酶的存在是结核菌具有活性的标志之一，如果在培养中加入某种药，控制了该酶的产生，则说明某种药物对结核分枝杆菌有杀菌效果。否则尿素酶继续产生，利用该机制我们设计了结核分枝杆菌耐药性的尿素酶测定试验。现将我们的研究结果报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  菌种：本室保存的耐药结核分枝杆菌菌株，临床标本常规处理后，分离培养鉴定结核分枝杆菌菌株。对照菌株购自生物药物鉴定所细菌室（菌株编号H37RV）。

    1.1.2  培养基：绝对浓度法采用豆浸液改良罗氏培养基［１］；尿素酶法采用含尿素和酚红指示剂的结核分枝杆菌液体培养基（苏通氏培养基）。

    1.1.3  抗痨药物：14种抗痨药物均购自上海医药集团有限责任公司信宜制药总厂，其中利福平(RFP)、 异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、 利福定 (RFD)、利福喷丁(RFPD)、吡嗪酰胺（PAZ）、立刻肺疾、卷曲霉素(CPM)、环丝氨酸(CS)取得该厂的纯品药物；而卡那霉素(KM) 、对氨柳酸（PAS）、丁胺卡那、奥复星、链霉素(SM) 使用该厂的注射用瓶装药，取得了该厂此批药物的药物效价，并严格按照结核病诊断细菌学检验规程中,抗结核药物溶液配制及稀释的方法进行计量的折算［１］。

    1.2  方法

    1.2.1  含尿素结核分枝杆菌培养基的制备：成分：天门冬酸4.0 g,枸橼酸2.0 g, k2HpO4 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g，0.1%酚红25 mL,枸橼酸铁铵0.05 g,甘油 60 mL,蒸馏水1 000 mL，尿素 12 g(0.12%)［１］，另外采用固体方法进行药敏试验时，培养基可选择改良罗氏培养基。其制备方法略有不同。

    制备方法：将上述成分混合于蒸馏水中，加温溶解，调pH为6.8，过滤，分装三角烧瓶，每瓶装99 mL，121.3 ℃15 min，高压灭菌，4 ℃～8 ℃冰箱保存备用。

    1.2.2  琼脂绝对浓度法培养基的制备与药物的浓度：绝对浓度法严格根按照中国防痨协会，结核病诊断细菌学检验规程的方法操作［1］。

    1.2.3  试验菌液的配制：将试验菌接种于豆浸液结核分枝杆菌培养基培养20 d，待生长至培养基斜面的1/3以上时，刮取菌落，粘磨，并用硫酸钡比浊管比浊，用Teen-80生理盐水配成5×105/mL～5×106/mL菌悬液，采用10倍递次稀释，待用。

    1.2.4  药敏试验的操作方法：将分离培养、鉴定，并稀释配置成5×103 cfu/mL的浓度的结核分枝杆菌，分别接种在已分装好的,含有药物的14管培养基中，每管接种0.2 mL，使每管培养基中的细菌浓度约为500 cfu/mL，每种药物分别作高低两种浓度的试验，设空白对照各1管, 尿素酶阳性菌株对照1管，37 ℃培养7 d～10 d, 以阳性菌株的培养液呈现红色,为终止培养的判定终点。同时用传统结核分枝杆菌耐药测定法-绝对浓度法，进行接种作为对照，观测其该方法（尿素酶法）与传统法在耐药性检测中的相符性或有无显著的差异。

    1.2.5  结果判断：培养基呈现红色为耐药，培养基呈现黄色为敏感，培养基呈现淡红色为中度敏感（或中度耐药）。

    1.2.6  质控方式：每次均用结核分枝杆菌H37RV药物敏感株作对照，进行质量控制。

    1.2.7  数学统计：采用配对资料的卡方检验以及符合率的。

    2  结果

    两种方法检测临床鉴定结核分枝杆菌耐药性的结果分析，见表1～表4。表1  两种方法检测结核分枝杆菌对14种抗痨药物耐药结果从表1的结果分析，尿素酶法检出耐药菌株173株，总耐药率24.3%；传统绝对浓度法检出耐药菌株180株，总耐药率25.7%。经卡方检验，尿素酶检测法与传统绝对浓度法，在对上述结核分枝杆菌的耐药性检测中，差别无显著性（χ２=2.25，P＞0.10）。说明尿素酶法在对结核分枝杆菌的耐药性检测方面具有可靠性，其检出结果与传统绝对浓度法具有可比性，两种方法无显著性差异。表2  两种方法检测167株结核分枝杆菌对利福定耐药性结果的比较表2的结果分析若以传统绝对浓度法检测的结果为判断标准，则尿素酶法检测RFD耐药性符合率为96.4%。 表3  尿素酶法检测50株对吡嗪酰胺耐药的结核分枝杆菌重复性试验结果比较
对临床分离鉴定的并用绝对浓度法测定的50株耐吡嗪酰胺的结核分枝杆菌，用尿素酶进行了耐吡嗪酰胺的重复性试验，首次检测耐药菌株数48株，敏感2株；再次检测，敏感菌株为1株，耐药菌株49株，符合率94%（47/50）。

    武延隽等.利用尿素酶试验测定结核分支杆菌耐药性的方法学研究表4  两种方法检测5种规定必作药敏结果

    药物尿素酶法测定结果传统绝对浓度法测定结果敏感株耐药株符合率(%)异烟肼（n=50）敏感株350  耐药株015100乙胺丁醇（n=50）敏感株450  耐药株05100链霉素（n=50）敏感株52  耐药株04396对氨柳酸（n=50）敏感株355  耐药株01090利福平（n=50）敏感株350  耐药株51090

    用两种方法检测50株临床分离鉴定的结核分支杆菌对5种必作药物的耐药性，结果见表4。检测异烟肼药敏结果相符50株（100%）。不符0株（0%）；检测乙胺丁醇药敏结果相符50株（100%），不符0株（0%）；检测链霉素药敏结果相符48株（96%），不符2株（4%）；检测对氨柳酸药敏结果相符45株（90%），不符5株（10%）；检测利福平药敏结果相符45株（90%），不符5株（10%）。

    3  讨论

    尿素酶试验是鉴定性试验，应用于结核分枝杆菌的耐药性检测，主要是通过恢复性试验，观测尿素酶检测结果的敏感试验管和耐药试验管中细菌的存活情况，本文结果显示，在耐药试验管中的结核分枝杆菌，在无药的豆浸液罗氏培养基中生长，而敏感试验管中的结核分枝杆菌在该培养基中不生长。特异试验进一步证实，处死菌尿素酶试验均为阴性，而未处死菌均为阳性，表明通过尿素酶方法所检出的药敏试验的特异性。

    在对结核分支杆菌的耐药性检测中，用两种方法检测异烟肼、乙胺丁醇相符率为100%；检测链霉素相符率为96%；检测PAS和利福平相符率90%。尿素酶检测法与传统绝对浓度法差别无显著性（χ２=2.25，P＞0.10）；说明尿素酶法与传统的绝对浓度法检出的结果具有可比性。然而，尿素酶法是利用细菌生理状态的改变，来确定细菌对某种药物的敏感性的，这种方法比绝对浓度法时间短，绝对浓度法的结果需要30 d的时间，而尿素酶法最长时间10 d；尿素酶法在培养基的制备，具体的操作上都比较容易，有利于临床推广使用。

    应当指出的是：因有些分枝杆菌的尿素酶均为阴性，如戈氏分枝杆菌，蟾蜍分支杆菌，鸟分枝杆菌以及胞内分枝杆菌，尿素酶方法不能用于这些分枝杆菌株的耐药性的检测；该方法的灵敏度与噬菌体生物裂解法有一定的近似性，在500 cfu/mL时以上时，结果在3 d内显现;在500 cfu/mL内时,其结果在培养7 d～10 d内显现，所以当标本中菌数较少时一般不要做直接的尿素酶法的耐药性测定，直接对标本中的结核分枝杆菌进行耐药性测定的条件有待进一步研究；该试验所用的培养基的pH值对试验的结果有一定的影响，所以用弱酸弱碱处理过的试验菌一定要进行pH值的调整，应将pH值调整至6.8，否则影响试验结果。在试验所用的培养基中不可用天门冬素（Ｌ-天门冬酰胺），有该药的培养基经高压消毒灭菌后Ｌ-天门冬酰胺可破坏产生胺可使培养基的pH值改变，显示红色。

    总之，尽管有多种因素可影响该试验的结果，但因本方法操作简便，省时，有一定的特异性和敏感性，所以将对结核分枝杆菌耐药性检测提供一种新方法。

【】
  ［１］ 防痨协会．结核病诊断细菌学检验规程．中国防痨杂志，1996，18：28．

［２］ 李舍花，武延隽．豆浸液培养基快速培养结核分支杆菌的研究．中国防痨杂志，１998,20（3）：135．

［３］ 张卓然．临床微生物学和微生物检验．第3版．北京：人民卫生出版社，2003，509～511.

［４］ 屠得华．耐药结核病及防治对策．中国防痨杂志，1997,19:140～141.

［５］ 马曾鲁,邹级谦.肺结核患者耐药问题．中国防痨杂志，1991,13:43～45.

［６］ 胡忠义,靳安佳.结核分支杆菌耐药性检测研究进展,临床肺科杂志,2000,5:116～119.

［７］ Pilhen JA. Tuberculosis　2000:probiems and solutins.Int J Tuberc Lung dig,1998,2:696～703．

［８］ 胡忠义．结核分枝杆菌耐药性快速测定方法及其评价．中华结核和呼吸杂志，2003,(2)2:107～109.