塞来昔布对体外宫颈癌细胞株Hela和Siha的抑制作用
【摘要】 目的：探讨环氧化酶抑制剂塞来昔布对Hela和Siha细胞株细胞周期及凋亡的影响。方法：采用细胞培养技术及流式细胞术检测环氧化酶抑制剂塞来昔布对人宫颈癌细胞株（Hela和Siha）细胞周期及凋亡的影响。结果：经流式细胞术分析显示，随着塞来昔布浓度的增加，Hela和Siha细胞周期中G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，G２～M期细胞比例无明显改变。与塞来昔布（≥25 μmol/L）共同孵育72 h后，与空白对照组相比PI指数减小（P＜0.05），凋亡率增高（P＜0.05）。流式分析图中可见亚二倍体凋亡峰。结论：环氧化酶抑制剂塞来昔布可抑制体外人宫颈癌细胞株Hela和Siha的增殖、促进细胞凋亡。
【关键词】 宫颈癌；塞来昔布；流式细胞术
Abstract Objective:To study the inhibitory effects of celecoxib,a selective cyclooxygenase-2 inhibitor,on two cervical carcinoma cell lines in vitro.Methods:The effect of cell cycle and cell apoptotic rates were analyzed by flow cytometry (FCM).Results:By FACS,it was found that the cell cycles of Hela and Siha cells were blocked by celecoxib,with the increasing of concentration:the G0/G1 phase ratio of Siha /Hela were increased,the S phase ratio were inhibited and the G2～M phase ratio were not effected significantly.When incubated with celecoxib（≥25μmol/L）for 72 hours,the proliferation indexes(PI)were reduced（Ｐ＜0.05）,while the apoptotic rates were increased(P＜0.05),we can find sub- G1 summit in FACS graph.Conclusion:Celecoxib inhibited the proliferation and induced the apoptosis of Siha and Hela cell lines in vitro.
Key words Cervical cancer；Celecoxib；Flow cytometry
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，是癌症造成妇女死亡的第二位原因。近年来的研究表明，环氧化酶(COX)，尤其是COX-2，与多种上皮性肿瘤的发生、关系密切［１］，并发现COX抑制剂在抑制肿瘤的发生、发展过程中发挥一定作用，但有关环氧化酶及其抑制剂与宫颈癌发生、发展之间关系的研究较少，因此我们采用细胞培养技术及流式细胞术检测选择性COX-2抑制剂塞来昔布对人宫颈癌细胞株（Hela和Siha）增殖和凋亡的影响，为进一步探讨COX抑制剂抗肿瘤作用的机制及其临床应用积累资料。
1 材料与方法
1.1 材料
人宫颈癌细胞株Hela及Siha购自第四军医大学附属西京妇产科实验室。培养基RPMI1640购自Gibco BRL公司，小牛血清购自杭州四季青生物公司，胰酶购自sigma公司。塞来昔布购自山西威尔克科技发展公司，并溶于100％二甲基亚砜中，存于4 ℃备用。细胞培养与流式细胞分析均于山西医科大学中心实验室进行。
1.2 方法
1.2.1 细胞的培养： 人宫颈癌细胞株（Hela和Siha）采用RPMI 1640培养液，内含10％灭活小牛血清，常规培养于37 ℃、5％CO2、饱和湿度的孵箱中，用0.25％胰酶消化传代。
1.2.2 与药物共同孵育后经流式细胞仪分析： 选对数生长期的细胞按1×105/mL的浓度接种于六孔培养板中，次日更换培养液后与不同浓度的塞来昔布共同孵育，使其终浓度分别为12.5 μmol/L，25 μmol/L，50 μmol/L，并设相应的空白对照组，空白对照组及各不同浓度组均做两瓶。共同培养72 h后胰酶消化（0.25％），收集细胞制成1×106/mL的单细胞悬液，加入4 ℃预冷的70％乙醇固定细胞，PBS漂洗2次，用1 mL PBS液重新悬浮细胞，加碘化丙啶，避光染色20 min后通过流式细胞仪检测,应用DNA细胞周期分析软件，出各样品DNA含量，分析细胞周期及凋亡率。细胞的增殖活性以增殖指数( proliferative index, PI )表示，计算公式为:
PI(%)=（S％+G2～M％）/（G0～G1％+S％+G2～M％）×100%。
1.2.3 统计方法：采用SPSS for Window10.0软件包进行统计分析，多个样本均数间的比较用方差分析，P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
塞来昔布对Hela和Siha细胞周期及细胞凋亡的影响：如表1、表2所示，与各浓度的塞来昔布共同孵育72 h后，随着药物浓度的增加，Siha及Hela细胞周期发生变化：G0～G1期细胞增多，S期细胞减少，G2～M期细胞比例无明显改变。同对照组相比Siha及Hela细胞PI增殖指数减小（P＜0.05），凋亡率增高（P＜0.05），流式分析图中可见亚二倍体凋亡峰（见表3，图1、图2）。表1 塞来昔布对Siha细胞株细胞周期的影响表2 塞来昔布对Hela细胞株细胞周期的影响 表3 塞来昔布对Siha/Hela细胞株PI增殖指数及凋亡率的影响 * 与空白对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）
3 讨论
环氧化酶抑制剂属于非甾体类抗炎药（NSAIDs），临床上常用于消炎、镇痛、解热等。自100年前第一种NSAIDs药物阿司匹林由Felix Hoffman合成，至今世界上已有50种以上不同的NSAIDs化合物投放市场。随着对两种环氧化酶COX-1和COX-2的认识，NSAIDs药物根据它们对两种环氧化酶的选择性不同有了进一步分类，即非选择性COX抑制剂（对COX-1和COX-2的抑制作用相似或对COX-1的抑制作用更强），以及高度特异性抑制COX-2的选择性COX-2抑制剂。前者为传统的NSAIDs，包括阿斯匹林、扑热息痛、消炎痛等，后者包括新开发的Celecoxib (塞来昔布）、Rofecoxib（罗非昔布）、NS-398等。
80年代以来，一些大型流行病学调查发现长期使用COX抑制剂（NSAIDs）治疗类风湿性关节炎的患者，结肠癌发病率下降40%～60%，同时也可明显减少和预防食管癌、胃癌等发生的危险性。而且家族性腺瘤性息肉病患者长期服用小剂量NSALDs后，结肠息肉数目和大小均明显降低［２］。这使得COX抑制剂成为预防和治疗肿瘤的一个新靶点。
本实验选择了一种选择性COX-2抑制剂塞来昔布，采用流式细胞术，对Hela（属于人宫颈腺癌细胞株）和Siha（属于人宫颈鳞癌细胞株）两种细胞株进行细胞周期及细胞凋亡的分析。实验中S%反映细胞增殖能力,增殖旺盛的细胞S%较高。PI增殖指数代表了该细胞群体中增殖期细胞的数量,在一定程度上可反映细胞的增殖状态。本研究发现，同塞来昔布共同孵育72 h后，Hela和Siha细胞株的细胞周期发生改变：G0～G1期细胞增多，S期细胞减少，G2～M期细胞比例无明显改变，PI增殖指数减小，细胞凋亡率增加，流式图中可见亚二倍体凋亡峰。实验结果提示，这种药物主要是通过将细胞阻滞在细胞周期的G0～G1期，从而不同程度地抑制了体外人宫颈癌细胞株Hela和Siha的增殖，并诱导细胞凋亡。Douglas等已分别对人结肠癌、直肠癌、皮肤癌、脑胶质细胞瘤、胰腺癌等细胞进行NS398（一种选择性COX-2抑制剂）体外抑制作用，结果均提示，NS398能够抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡［３］。有研究认为，一方面COX抑制剂可通过调节bcl-2家族的表达诱导细胞凋亡［４］；另一方面, COX抑制剂可能通过蛋白激酶C（PKC）依赖途径调节肿瘤细胞的凋亡［５］。
以往研究表明，NSAIDs有副作用，如对肾和消化道粘膜的损害等，这是由于COX-1被抑制所致，而其治疗作用则归功于对COX-2的抑制。传统的NSAIDs同时阻断了 COX-1和COX-2，因此有胃肠道溃疡和出血等副作用［６］。现有研究发现，选择性 COX-2抑制剂与传统的NSAIDs疗效相同，但并不抑制血小板的活性，特异性的 COX-2抑制剂塞来昔布等药物所引起的具有临床症状的溃疡和溃疡并发症要少于传统的 NSAIDs［７］。目前已经有特异性的COX-2抑制剂应用到预防、治疗结肠癌的临床中去。因此开发利用疗效好，价格低，副作用少的COX-2抑制剂并将其应用到预防、治疗宫颈癌的临床中将有良好的应用前景。
【】
［１］ Dannenberg AJ,Altorki NK,Boyle JO,et al.Cycooxygenase-2:a pharmacological target for the prevention of cancer.Lancet Onclol,2001,2:544～555.
［２］ Oshima M,Dinchuk JE,Kargman SL,et al.Suppression of intestinal polyposis in APC delta 716 knockout mice by inhibition of cyclooxygenase-2（COX-2）.Cell,1996,87:803～809.
［３］ Douglas JE,Elder,Dawn E,et al.Apoptosis induction and cyclooxygenase-2 regulation in human colorectal adenoma and carcinoma cell lines by the Cyclooxygenase-2-selective Non-steroidal anti-inflammatory drug NS398.Int J Cancer,2000,86:553～560.
［４］ Aggarwal S,Taneja N,Lin L,et al.Indomethacin-induced apoptosis in esophageal adenocarcinoma cells involves upregulation of Bax and translocation of mitochondrial cytochrome C independent of COX-2 expression.Neoplasia,2000，2(4):346～356.
［５］ Zhu GH,Wong BC,Eggo MC,et al.Nonsteroidal antiinflammatory drug induced apoptosis in gastric cancer cells is blocked by protein kinase C activation through inhibition through of c-myc.Br J Cancer,1999,79:393～400.
［６］ Vane JR,Botting RM.Anti-inflammatory drug and their mechanism of action.Inflamm Res,1998,47（2）:78～87.
［７］ Feldman M,McMahon AT.Do cyclooxygenase-2 inhibitors provide benefits similar to those of traditional nonsteroidal anti- inflammatory drugs,with less gastrointestinal toxicity.Ann Intern Med,2000,132（2）:134～１43.
