不对称钌(Ⅱ)配合物的合成及其与DNA作用方式研究

             作者：管小艳，刘云军，何丽新，陆家政，梅文杰  

【摘要】  目的与方法 合成一个新的钌（Ⅱ）多吡啶配合物［Ru(4,7?dmp)2(PYNI)］(ClO4)2 ［4,7?dmp=4,7?二甲基?1,10?菲咯啉，PYNI=2?（2′?吡啶）萘基咪唑］，用元素分析、电喷雾质谱、核磁共振谱对该配合物进行表征；用吸收光谱、荧光光谱、黏度测试和DNA熔点测定研究配合物与DNA的作用。结果与结论 配合物［Ru(4,7?dmp)2(PYNI)］(ClO4)2与DNA之间通过插入模式结合。

【关键词】  钌（Ⅱ）配合物；DNA；光谱性质；黏度测试
　　Abstract:Objectiveand Methods  A new Ruthenium(Ⅱ) polypyridyl complex ［Ru(4,7?dmp)2(PYNI)］(ClO4)2 ［4,7?dmp=4,7?dimethyl?1,10?phenanthroline, PYNI=2?(2′?pyridyl)naphthoimidazo?imidazole)］has been synthesized and characterized by elemental analysis, ES?MS and 1H NMR. The DNA?binding behaviors were investigated by electronic absorption spectroscopy, fluorescent spectroscopy, viscosity measurement and DNA melting experiment.  Results and Conclusion The results showed the complex ［Ru(4,7?dmp)2(PYNI)］2+binding to DNA through intercalation mode.

　　Key words:ruthenium (Ru) complex; DNA; spectral properties; viscosity measurement

    近年来，人们对小分子过渡金属多吡啶配合物与大分子DNA相互作用的研究逐步深入，这一研究已经成为生物无机化学领域十分活跃的研究课题。八面体多吡啶钌金属配合物与DNA的作用引起了人们极大的兴趣［1,2］，与其他金属配合物相比，这类配合物易于构造一个既为刚性又带手性的八面体构型，并且配合物的热力学稳定性好，光化学和光物理信息丰富，既可以作为DNA结构探针［3］，又可以作为DNA分子光开关、DNA介导的电子转移、DNA断裂试剂［4］等。研究表明这些配合物能够以插入、静电和沟面结合三种方式与DNA作用，其中插入模式最为重要，因为配合物的很多性质都与插入结合有关。本文合成了一个新的钌(Ⅱ)多吡啶配合物［Ru(4,7?dmp)2(PYNI)］(ClO4)2 ［4,7?dmp=4,7?二甲基?1,10?菲咯啉，PYNI=2?（2′?吡啶）萘基咪唑］，合成路线见图1。

　　用元素分析(EA)、电喷雾质谱(ES?MS)、核磁共振(1H NMR)对配合物进行详细的表征。采用电子吸收光谱、荧光光谱、黏度测试和DNA熔点测定研究配合物［Ru(4,7?dmp)2(PYNI)］(ClO4)2与DNA作用，研究结果表明［Ru(4,7?dmp)2(PYNI)］2+通过插入方式与DNA结合。

　　1  实验部分

　　1.1  试剂和仪器
    　　
　　实验中使用试剂均为分析纯，使用前未经进一步纯化，缓冲溶液用双蒸水制备；DNA购自华美公司，用Tris（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液配成一定浓度的储备液于冰箱中保存；配合物用5 mmol/L Tris?HCl，50 mmol/L NaCl(pH=7.0)缓冲溶液配制。
       
　　LCQ电喷雾质谱仪(ESMS, Finnigan)，快原子轰击质谱（FAB?MS)使用VG ZAB?HS质谱仪，Elemental Vario EL 元素分析仪，Bruker ARX?500型核磁共振仪，Shimadu?UVPC?3000 型紫外?可见光谱仪，荧光光谱用Rf?4500荧光光谱仪测试，黏度测试使用乌氏黏度计。

　　1.2  配合物［Ru(4,7?dmp)2(PYNI)］(ClO4)2的制备

　　称取0.312 g cis?［Ru(4,7?dmp)2Cl2］·2H2O［5］(0.5 mmoL), 0.123 g PYNI［6］(0.5 mmoL) 混合物加入乙二醇15 mL，加热至150  ℃氩气保护下反应8 h，得红色清液。冷却至室温，过滤，加40 mL水稀释后，加入NaClO4的饱和溶液即产生大量红色沉淀。抽滤，用水，乙醚洗涤数次后干燥。将干燥后的粗产品用少量乙腈溶解，用中性氧化铝（200 mesh）柱分离。在V（甲苯）∶V（乙腈）=1∶3 混合溶剂淋洗下收集红色组分，然后减压，蒸去溶剂，得红色固体,产率62%。元素分析，实测值（%）：C 54.96，H 3.64，N  10.23；值(%)：C 54.95，H 3.67，N  10.19。1HNMR (DMSO?D6, 500 MHz) δ：8.34 (d, 1H, J=8.8 Hz), 8.23 (d, 1H, J=8.5 Hz), 8.19 (d, 2H, J=8.6 Hz), 8.03 (d, 1H, J=8.5 Hz), 7.88 (t, 2H, J=7.8 Hz), 7.75-7.79 (m, 2H), 7.67 (d, 1H, J=8.8 Hz), 7.47 (d, 2H, J=8.0 Hz), 7.45 (d, 2H, J=8.2 Hz), 7.23 (t, 1H, J=7.6 Hz), 7.12-7.17 (m, 2H), 7.05-7.09 (m, 2H), 7.03 (d, 1H, J=8.4 Hz), 6.81 (d, 1H, J=8.5 Hz), 5.00 (s, 1H), 2.05 (s, 6H), 2.01 (s, 6H)。 ES?MS (CH3OH): m/z 762 (［M?2ClO4?H］+), 382 (［M?2ClO4］2+)。

　　1.3  实验方法
    　　
　　在紫外可见光谱仪中，参比池中加入3　mL的缓冲液，在样品池中加入同样体积的20　μmol/L的配合物溶液，用微量加样器每次往参比池和样品池中分别加入相同体积的DNA储液，使DNA与配合物浓度比值（CDNA/CRu）按一定的比例递增，直至饱和，吸收峰不再减色。每次混和均匀约5 min后，在200～800　nm范围监测配合物的电子吸收光谱变化。配合物［Ru(4,7?dmp)2(PYNI)］(ClO4)2与DNA结合常数根据下列方程求得［7］

　　［DNA］εa-εb=［DNA］εa-εf+1Kb(εb-εf)
   
　　［DNA］代表DNA的浓度εa，εf ，εb分别是配合物与DNA结合，自由配合物和配合物与DNA结合达到饱和时的摩尔吸光系数，Kb为配合物与DNA结合常数，Kb由拟合直线与Y轴相交的截距求得。
    　　
　　荧光光谱研究中，配制钌配合物溶液 (2 μmol/L)，用微量加样器每次往样品池中加入相同体积的DNA储液，使DNA与配合物浓度比值（CDNA/CRu）按一定的比例递增，直至饱和。每次混和均匀约5 min后，用Rf?4500荧光光谱仪在500～800 nm范围监测配合物的荧光光谱变化。用450 nm光源激发，记录发射光波峰和发光强度。
   
　　黏度用乌氏黏度计测量。测量黏度时，温度恒定在(28±0.1) ℃。固定DNA的浓度，逐渐增加Ru配合物浓度。相对黏度按下式计算：

    η=( t-t0)/ t0

    上式中，t0为缓冲液流经毛细管所需的时间，t为DNA溶液(含浓度不等的 Ru配合物)流经毛细管所需的时间。以 (η/η0 )1/3对比率r(r=［Ru］/［DNA］)作图。η0为未加钌配合物时DNA溶液的相对黏度。
   
　　DNA熔点测定实验，用紫外?可见光谱仪监测DNA溶液在有无配合物存在下，在260 nm处的吸收峰强度的变化。

　　2  结果与讨论

　　2.1  配合物与DNA作用吸收光谱
       
　　配合物的MLCT（metal?to?ligand charge transfer transition）吸收峰的强度在有DNA存在时有一定的减小，这通常被认为是插入作用的特征之一。产生减色效应的原因是DNA碱基对于插入配体间发生π电子堆积，使后者的π*空轨道上也有一定的电子填充，从而使MLCT跃迁的几率减小。而减色效应的强弱，也能反映插入能力的大小，插入能力越强，减色效应越强。图2（小图表示配合物与DNA结合常数）表明随着小牛胸腺DNA(CT?DNA)加入，配合物的电子吸收光谱发生减色和一定程度的红移，金属到配体电荷跃迁(MLCT)峰(462 nm)，在室温时减色率为21.7%，红移4 nm。配合物与DNA的结合常数Kb=2.83×104 M-1。配合物与DNA结合常数类似先前报道的配合物与DNA结合常数［6］。

　　=20 μmol/L. Arrow shows the absorption change upon the increase of DNA concentration

　　2.2  荧光光谱
    　　
　　荧光光谱法是一种比较灵敏的测试方法，广泛用于研究配合物与DNA的相互作用。若钌(Ⅱ)多吡啶配合物在某种条件下发荧光，当加入DNA后，荧光增强，说明配合物与DNA发生某种方式的结合。荧光增强幅度的大小，一般反映配合物与DNA作用的强弱。配合物［Ru(4,7?dmp)2(PYNI)］2+与DNA作用的荧光变化如图3，随着DNA的加入，配合物的荧光增强4.0倍。配合物与DNA作用荧光增强的原因在于DNA有效保护了配合物，使之不受水分子的进攻。

　　2.3  黏度测试
       
　　流体力学法即黏度法是研究配合物与DNA作用模式的另一种最有力的实验方法，因为它对DNA的长度变化比较敏感。一般来说，如果配合物与DNA以插入方式作用，由于插入配体进入到DNA的碱基对中，导致DNA双螺旋链伸长，由此使DNA的相对黏度增大；当配合物与DNA以部分插入DNA时，会导致DNA的双螺旋链的弯曲或褶皱，长度减小， 因而其黏度下降。当配合物以静电作用与DNA结合，DNA溶液的黏度几乎不变。图4是配合物［Ru(bpy)2(dppz)］2+(■)，［Ru(4,7?dmp)2(PYNI)］2+(▲)和［Ru(bpy)3］2+(●)与DNA作用的黏度变化图。已知［Ru(bpy)2(dppz)］2+是典型的DNA插入试剂，与DNA溶液作用时，溶液的黏度明显升高；［Ru(bpy)3］2+是以静电作用与DNA结合，其DNA溶液的黏度没有明显变化；当配合物［Ru(4,7?dmp)2(PYNI)］2+与DNA溶液结合时，DNA溶液的黏度稳定增加，类似配合物［Ru(bpy)2(dppz)］2+与DNA作用，但作用强度不如后者，因此［Ru(4,7?dmp)2(PYNI)］2+与DNA作用是以插入方式结合的。

　　2.4  DNA熔点测定
    　　
　　DNA熔点测定是研究过渡金属配合物与DNA相互作用的一个重要方法，通过DNA熔点测定实验可以测得DNA的熔点。DNA在受热过程中，碱基对之间的氢键遭到破坏，DNA两条链逐步解离而发生变性，以温度为横坐标，以260 nm处吸收率为纵坐标作图得到的曲线称为热变性曲线，当达到熔点温度Tm时，有50% DNA由双链改变为单链。一些能作为DNA插入试剂的天然或合成的有机化合物和金属有机配合物与DNA的作用，由于插入试剂与DNA碱基对之间能发生π?π堆积，使DNA的双螺旋变得稳定，从而使DNA的熔点(Tm)明显升高［8-10］。图5显示DNA在有无配合物 ［Ru(4,7?dmp)2(PYNI)］2+的情况下260 nm处吸光强度随温度的变化。实验测得DNA的熔点为(74.3 ± 0.5) ℃，在配合物 ［Ru(4,7?dmp)2(PYNI)］2+存在时，DNA的熔点升高了5.3 ℃,表明配合物与DNA之间是通过插入方式结合的。

　　3  结  论
    　　
　　本文合成了一个新的不对称钌(Ⅱ)多吡啶金属配合物Ru(4,7?dmp)2(PYNI)］(ClO4)2，并用元素分析、电喷雾质谱和1HNMR进行表征。光谱实验、黏度测试和DNA熔点变化表明配合物［Ru(4,7?dmp)(PYNI)］2+与DNA是通过插入作用结合的。

【】
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