手性钌配合物Δ?［Ru(bpy)2IPBP］2+的合成及其细胞毒作用

                 作者：梅文杰，王娜，刘云军，马玉卓，谢华松，梁宝霞 

【摘要】  目的 采用Δ?［Ru(bpy)2(py)2］［o,o′?dibenzoyltartrate］·12H2O和3?醛基色酮为原料，制备手性钌多吡啶配合物Δ?［Ru(bpy)2IPBP］2+ (Δ?1) (bpy=bipyridine, IPBP=2?(4?甲苯并吡喃?2?酮)咪唑［4,5?f］［1，10］菲咯啉)，并对其体外抗肿瘤活性进行初步评价。方法　采用元素分析，电喷雾质谱(ESI?MS)，核磁共振(NMR)等对目标化合物进行了表征，并采用MTT法初步研究了配合物Δ?1对人肝癌细胞Bel?7402，肺腺癌细胞HCT?8有明显的抑制作用。结果与结论　目标化合物的元素分析、电喷雾质谱实验结果与理论值基本一致；当配合物浓度为50 μg/mL时，配合物Δ?1对人肝癌细胞Bel?7402，肺腺癌细胞HCT?8有明显的抑制作用。

【关键词】  手性；钌(Ⅱ)配合物；细胞毒作用;肺腺癌细胞
　　
　　Abstract:Objective To preparation a novel chiral ruehtnium(II) complexes, Δ?［Ru(bpy)2IPBP］2+ (Δ?1) (bpy=bipyridine, IPBP=2?(4?methy?1?benzopyran)imidazo［4,5?f］［1,10］ phenanthroline) and evaluate its antitumor activity. Methods The target compound Δ?1 was synthesized and characterized by elementary analysis, ESI?MS and 1H NMR, and the cytotoxicity of this ruthenium(II) complex Δ?1 against human hepatocarcinoma cell line Bel?7402 and human intestinal adenocarcinoma cell line HCT?8 and human lung adenocarcinoma epithelial cell line A?549 were also investigated by MTT methods. Results and conclusion The studies showed that Δ?1 exhibited excellent antitumor activities against Bel?7402 hepatocarcinoma cells and HCT?8 intestinal adenocarcinoma cells at dose of 50 μg/mL.

　　Key words:chiral;ruthenium(II) complexes;cytotoxicity
      
　　1969年，Rosenberg 发现顺铂具有抗肿瘤活性，并在临床上广泛应用以来，金属配合物，特别是钌配合物与生物大分子的相互作用已经成为化学生物学、配位化学、金属小分子药物等领域的研究热点之一［1-2］。一般认为，DNA是抗肿瘤药物的生物学靶点之一，小分子药物通过与DNA分子的缔合，对其生物功能进行微扰，达到抑制肿瘤生长的目的［3-4］。研究发现钌配合物能够以插入作用，沟面结合以及静电相互作用方式与DNA分子结合，并且能够在肿瘤组织中发生富集作用［5-6］，在抗肿瘤药物研究中展现出广阔的应用前景。G. Sava等人报道，钌配合物trans?［HIm］［Ru(Ⅲ)Cl4 (DMSO)(Im)］ (NAMI?A)具有很强的抗肿瘤转移作用［7］；C. Scolaro等利用苯分子具有强的疏水性的特点，用取代苯作为配体合成了一系列的Ru(II)配合物，这些钌配合物在体外实验中都表现出很强的抗肿瘤活性［8］。
        
　　但是手性钌配合物作为抗肿瘤药物的研究迄今仍然鲜见报道。国内外研究报道，具有刚性八面体结构的手性钌配合物在与DNA的缔合时，存在手性选择性，Ji等人的研究表明，以插入方式与DNA结合的手性钌配合物，其Δ－异构体对B?DNA具有较强的亲合作用［9］。本文设计合成了一个新型的手性钌配合物Δ?［Ru(bpy)2IPBP］2+(Δ?1) (Fig.1)，并采用元素分析、电喷雾质谱、核磁等对配合物进行表征，采用MTT法研究了配合物Δ?1对人肝癌细胞Bel?7402，人肺腺癌细胞A?549和人结肠癌细胞HCT?8的抑制作用。

　　1  实验部分

　　1.1  试剂和仪器
        
　　小牛胸腺DNA从华美公司购买。DNA浓度采用光谱学方法测定。所有试剂和溶剂均为分析纯，除非另有说明，使用前未经处理。缓冲溶液使用双蒸水配制。
        
　　元素分析数据用Elementar Vario EL元素分析仪进行测量；电喷雾质谱数据(ESI?MS)在Thermo Finnigan LCQ DECA XP质谱仪上记录 (Finnigan MAT, USA)。荧光发射光谱在Shimadzu RF?5000荧光分光光度计上进行记录，吸收光谱在Shimadzu UVPC?3000分光光度计上记录，圆二色(Circular Dichroism, CD)谱在JASCO J20C光谱仪上记录。

　　1.2  2?(4?甲苯并吡喃?2?酮)咪唑［4,5?f］［1,10］菲咯啉(IPBP)的合成

    菲咯啉5,6?二酮参照［10］的方法合成。
   
　　2?(4?甲苯并吡喃?2?酮)咪唑［4,5?f］［1,10］菲咯啉(IPBP)参照文献［11］的方法合成。
   
　　将菲咯啉5，6?二酮 (0.25 g, 1.2 mmol)、3?醛基色酮(0.26 g, 1.5 mmol)和乙酸铵(1.9 g, 25 mmol)的冰乙酸(10 mL)溶液搅拌回流2 h。冷却，得到深红色溶液，加入25 cm3水，浓氨水调节pH至近中性，过滤，得到黄棕色固体，用乙醇溶解后，60～80目硅胶装柱，用乙醇淋洗，收集黄色第一色带，旋干，真空干燥，产率73%。元素分析 C23H、14N4O2·H2O，值（%）： C  69.7， H 4.07; N 14.1; 实测值（%）： C 69.3， H  4.12， N 13.7。 ES?MS (in DMSO, m/z): ［M+H］+378.6 (计算值 379.1)。

　　1.3  Δ?［Ru(bpy)2(IPBP)］(PF6)2·2H2O (Δ?1)的合成
      
　　将Δ?Ru(bpy)2(py)2］［o,o′?dibenzoyltartrate］·12H2O参照文献［12］的方法合成。
      
　　将Δ?Ru(bpy)2(py)2］［o,o′?dibenzoyltartrate］·12H2O (0.26 g, 0.2 mmol)和 IPBP (0.21 g, 0.3 mmol),加入到20 mL乙二醇?水(体积比9∶1)的混合溶液中，氩气保护下，回流6 h。冷却，加入40 mL去离子，过滤。滤液中加入过量NH4PF6饱和溶液，得到棕红色沉淀，抽滤，真空干燥。粗产品用少量乙腈溶解，氧化铝装柱，乙腈?甲苯(体积比2∶1)淋洗，收集橙红色第二色带，旋干，真空干燥，产率70%。元素分析 C43H30F12N8O2P2Ru·2H2O，计算值（%）： C 46.2， H 3.07， N 10.02; 实测值（%） ：C 45.6， H 3.14， N 9.93。1H NMR(in DMSO?d6, δ）: 9.47(1H, d, J=8.1 Hz, Ha′); 9.33(1H, s, N?H); 9.05(1H, d, J=8.2 Hz, Ha); 8.84 (4H dd,J1=8.1 Hz, J2=3.4 Hz, H6); 8.22(2H, t, J=7.7 Hz, Hb); 8.11(4H, dd, J=6.6 Hz, H4); 8.08(4H, d, J=6.6 Hz, H3); 7.96(1H, s, H1); 7.91(2H, d, J＝3.0 Hz, Ha); 7.83(2H, d, J＝5.2 Hz, Hc); 7.58(4H, d, J＝6.0 Hz, H5); 2.516(3H, s, Hm)。CD (in Tris?HCl，pH=7.2, λmax/nm): 291.0 (-) 。

　　1.4  钌配合物的细胞毒作用

    人肝癌细胞株Bel?7402)，人结肠癌细胞株HCT?8和人肺腺癌细胞株A?549由医学院药物研究所新药筛选中心提供。
    　　
　　钌配合物的细胞毒由中国医学科学院药物研究所筛选中心完成。一般方法是：选用对数生长周期的贴壁肿瘤细胞，胰酶消化后，用含体积分数10%小牛血清的RPMI?1640(Flow Laboratories，美国)培养液配成5 000个/mL细胞悬液，接种在96孔板中，每孔接种100 μL，将接种好的细胞板放入细胞培养箱中，37 ℃， 5% CO2培养24 h。然后加入样品或者5?氟尿嘧啶10 μL，加入RPMI?1640培养液，使每孔终体积为200 μL，37 ℃，5% CO2培养3 d。将细胞培养板中的营养液弃掉，每孔加入100 μL新鲜配制的0.5 mg/mL四氮唑［MTT, 3?(4,5?dimethylthiazol?2?yl)?2,5?diphenyl?tetrazolium bromide］的无血清培养液，放入37 ℃，5% CO2温箱中继续培养4 h。小心弃上清，加入200 μL DMSO，微型超声振荡器混匀，在酶标仪上测定波长544 nm处的光密度值。
    　　
　　肿瘤细胞生长抑制率(%)=(OD对照?OD实验)/(OD对照?OD空白)×100%

　　2  结果与讨论

　　2.1  手性配合物的合成与表征
        
　　目标化合物Δ?［Ru(bpy)2(IPBP)］(PF6)2·2H2O(Δ?1)的合成是在氩气保护下，用Δ?Ru(bpy)2(py)2］［o,o′?dibenzoyltartrate］·12H2O与IPBP回流制备得到的，粗产品采用柱层析方法进行分离纯化。
   
　　Δ?1乙腈溶液的电喷雾质谱在m/z为937.0，791.3和396.3各有一个分子离子峰（图2）,可分别归属于［M?2H2O?PF6］+ (理论值937.2)，［M?2H2O?2PF6?H］+ (理论值791.2)和［M?2H2O?2PF6］2+ (理论值396.1)。

　　在Tris?HCl(pH=7.2)缓冲溶液中，配合物Δ?1的吸收光谱在400～500　nm之间有一个中等强度的吸收，吸收峰的最大值在462　nm，归属于钌配合物的MLCT荷移跃迁(metal?to?ligand charge transfer)；在200～300　nm之间有一个强的吸收，吸收峰最大值在386　nm，可归属于钌配合物的IL荷移跃迁(intraligand charge transfer)吸收峰(图3)。
   
　　室温下，当用470 nm波长激发，钌配合物Δ?1的Tris?HCl(pH=7.2)缓冲溶液在500～700 nm出现一个强的荧光发射峰，荧光发射峰的最大值在595 nm(图4)。
      
　　钌配合物Δ?1的Tris?HCl(pH=7.2)缓冲溶液的圆二色谱(CD)在291.0有一个强的负CD信号(图5)，这与［9］中的报道是一致的。

　　2.2  手性钌配合物Δ?1的细胞毒作用
      
　　采用MTT法研究了钌配合物Δ?1对人肝癌细胞Bel?7402，人肺腺癌细胞A?549和人结肠癌细胞HCT?8的抗肿瘤活性，结果见表1。表1  钌配合物Δ?1对人肝癌细胞Bel?7402，人肺腺癌细胞A549和人结肠癌细胞HCT?8的抑制作用（略）
      
　　从表1数据可知，当药物浓度为50 μg/mL时，钌配合物Δ?1对人肝癌细胞Bel?7402和人结肠癌细胞HCT?8的抑制活性分别为86.8%和83.4%；在相同条件，阳性对照物5?氟尿嘧啶对人肝癌细胞Bel?7402和人结肠癌细胞HCT?8的抑制活性分别为77.1%和86.4%，表明钌配合物在抗肿瘤药物研究中具有潜在的应用前景。

【文献】
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