黄芩群体不同形态变异类型遗传多样性的AFLP分析
作者：杨全，罗烈伟，罗贵超，王文全，张卉
【摘要】 目的 研究黄芩群体形态变异类型的遗传多样性。方法 采用扩增片段长度多态性(AFLP)技术，对人工栽培群体的8个形态变异类型黄芩进行多态性分析。结果 通过筛选得到9对AFLP引物组合，共扩增出2 834个DNA条带，多态性条带为1 332个，多态性位点平均为47.8%。聚类分析结果表明，8个形态变异类型黄芩划分为4类。其中，绿茎、小叶、少分枝和紫色花类型与普通类型各自聚为一类，绿茎、大叶、少分枝和淡紫色花类型与紫红茎、大叶、少分枝和紫色花类型聚为一类，绿茎、小叶、多分枝和淡紫色花类型，绿茎、大叶、多分枝和紫色花类型，绿茎、小叶、多分枝和淡紫色花类型与紫红茎、小叶、多分枝和紫色花类型聚为一类。结论 人工栽培群体黄芩形态变异类型间存在较高多态性，遗传多样性较丰富。
【关键词】 黄芩；形态变异；扩增片段长度多态性；遗传多样性
Abstract:Objective To investigate the genetic diversity of morphological variation types in Scutellaria baicalensis Georgi.Method Using the AFLP technology, the polymorphisms of 8 cultivated variation types in S. baicalensis Georgi were analyzed.Results Using 9 pairs of AFLP primers screened, 2 834 DNA bands were amplified, among which 1332 were polymorphic. The polymorphic locus was 47.8% in average. Cluster analysis indicated that 8 morphological variation types of S. baicalensis Georgi were grouped into 4 classes. The green stem, small leaf, few branch, purple flower type and the common type were classified into one class. The green stem, big leaf, few branch, mauve flower type and the purple stem, big leaf, few branch, purple flower type were classified into one class. The green stem, small leaf, multi?branch, mauve flower type, the green stem, big leaf, multi?branch, purple flower type, the green stem, small leaf, multi?branch, mauve flower type, and the purple stem, small leaf, multi?branch, purple flower type were classified into another class.Conclusion The artificially cultivated S. baicalensis Georgi has high polymorphism among morphological variation types and rich genetic diversity.
Key words:Scutellaria baicalensis Georgi; morphological variation; amplified fragment length polymorphism; genetic diversity
黄芩Scutellaria baicalensis Georgi具清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效［1］，为常用中药材之一，是国家三级保护野生药材物种。近年来对黄芩药材的需求量剧增，导致野生资源被过度采挖，资源大幅减少。目前，人工栽培黄芩药材已经成为临床以及中成药原料的主要来源，但是，人工栽培黄芩由于种子混杂、退化等多种因素，不但药材的质量、产量差异较大［2-4］，而且群体中不同单株在茎颜色、株高、地茎、分枝数和叶片大小等农艺指标上存在显著差异［5］，严重影响了黄芩的大面积生产。本文采用扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,AFLP）技术，研究人工栽培群体不同形态变异类型黄芩在分子水平上的遗传变异，旨在揭示黄芩群体内的遗传多样性以及形态变异类型间的亲缘关系，为今后开展资源保存、种质鉴定奠定基础，同时有助于开展分子标记辅助选择育种研究。
1 材料与方法
1.1 试验材料
黄芩为栽培于北京市通州区农业技术推广站农业科技成果示范基地的2年生人工栽培群体内的形态变异类型，变异类型的名称以及划分指标见表1，每个变异类型选择5个单株，每株取1～2个成熟叶片，混合在一起，置装有变色硅胶的封口袋内，迅速干燥，备用。
表1 黄芩形态变异类型命名一览表（略）
Tab.1 A list of morphological variation types of Scutellaria baicalensis Georgi
注：普通类型为《植物志》所描述的植物形态类型
1.2 总DNA提取
采用CTAB［6］法进行黄芩总DNA提取。用U Itrospc 2000 紫外/可见分光光度计检测DNA的纯度及浓度。
1.3 AFLP分析
接头、引物序列以及实验方案按照鼎国生物技术公司AFLP试剂盒的技术说明书进行。总DNA用PstⅠ和MseⅠ进行双酶切，然后加入PstⅠ和MseⅠ接头和T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜。酶切连接产物稀释10倍后用于AFLP预扩增反应模板，预扩增反应条件为94 ℃/4 min；94 ℃/40 s；56 ℃/30 s；72 ℃/80 s；34个循环后，72 ℃延伸6 min。预扩增产物稀释20倍后用于选择性扩增的模板。
选择性扩增引物序列为PstⅠ和MseⅠ的核心引物序列加上3个选择性碱基。采用的引物组合为PstⅠ和MseⅠ引物组合。选择性扩增反应条件为：第一轮扩增参数94 ℃/4 min；94 ℃/30 s；65 ℃/30 s；72 ℃/80 s；以后每轮循环温度递减0.7 ℃，扩增13个循环；接着按照下列参数扩增24个循环：94 ℃/30 s；56 ℃/30 s；72 ℃/80 s。
1.4 数据处理
利用ABI 377测序仪进行AFLP多态性分析，依据DNA电泳分子量标准（Marker）出各片段的大小。按片段记录带的有无，有记为1，无记为0。采用GeneScan3.1 软件对图像进行处理，构建 0、1 数学矩阵；用NTSYSpc?2.11F软件进行数据分析。对原始矩阵用SimQual程序求DICE相似系数，并获得相似系数矩阵。用 SHAN程序中的 UPGMA进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 AFLP扩增结果及多态性分析
从64对AFLP核心引物组中筛选9对引物组合：P?GAA M?CAA（P20M17）、P?GAA M?CAC（P20M16）、P?GAA M?CTC（P20M21）、P?GAA M?CTG（P20M20）、P?GAA M?CTT（P20M24）、P?GTT M?CAA（P25M17）、P?GTT M?CAG（P25M21）、P?GTT M?CTC（P25M21）、P?GTT M?CTT（P25M24）。分别对8个变异类型黄芩进行多态性检测（图1）。共扩增出2 834个DNA条带（表2），多态性条带为1 332个，多态性位点平均为47.8%。引物对P25M15扩增的多态带最多为185条，而引物对P25M21扩增的谱带最少仅为111 条，不同引物对扩增出的多态带数量存在一定的差异，但每对引物所产生的多态带的比例比较高，引物对P20M21高达60.4％。
图1 引物组合P25M15、P25M21、P25M24（左→右）扩增电泳结果（略）
Fig.1 Amplified electrophoresis results of primer combi?nation P25M15, P25M21 and P25M24
表2 不同引物对的多态性分析（略）
Tab.2 Polymorphism analysis of different primer pairs
2.2 相似性及聚类分析
各个类型黄芩的遗传相似系数在0.72～0.84之间，表明各个类型间具有一定的遗传差异。从聚类分析图（图2）可以看出，当遗传距离系数在0.79左右时，可以将8个形态变异类型黄芩划分为A、B、C、D 4类。其中，绿茎、小叶、少分枝和紫色花类型与普通类型黄芩各自聚为一类，绿茎、大叶、少分枝和淡紫色花类型与紫红茎、大叶、少分枝和紫色花类型聚为一类，绿茎、小叶、多分枝和淡紫色花类型，绿茎、大叶、多分枝和紫色花类型，绿茎、小叶、多分枝和淡紫色花类型与紫红茎、小叶、多分枝和紫色花类型聚为一类。
图2 黄芩形态变异类型聚类图（略）
Fig.2 Cluster result of morphological variation of Scutellaria baicalensis Georgi
3 讨论
3.1 AFLP是基于RFLP和RAPD的PCR方法，具有多态性丰富、特征条带稳定和重复性好等优点。选用不同的引物组合，不同基因型DNA可以有不同的酶切位点，从而产生扩增片段的长度多态性，即使亲缘关系很近的品种间DNA差异也可以检测出来。近几年来，AFLP被广泛应用于作物品种鉴定、基因定位、种质鉴定和标记辅助育种等方面的研究［7,8］。
3.2 目前，关于黄芩的研究多集中在药理、药化以及栽培技术等方面，对黄芩遗传变异等分子生物学方面的研究较少。邵爱娟［9］等运用RAPD技术对全国34个种源黄芩的遗传多样性进行了分析，揭示出黄芩种源间遗传背景复杂，多样性丰富，但是对于群体内不同变异类型间的遗传特性研究未见报道。
本文运用AFLP技术对群体内黄芩变异类型间的遗传多样性进行研究，多态性研究结果表明，黄芩群体内变异类型的遗传多样性较丰富，平均多态性位点的百分率达47.8%。推测黄芩群体内DNA多态性高的原因主要是由于黄芩一直以来以野生为主，人工栽培刚刚起步，生产上没有真正意义上的栽培品种，种子来源混杂，并且没有进行系统筛选，保留了母本的某些遗传特性，所以具有较高的遗传多态性。因此，在进行黄芩优良品种选育过程中一定要重视和加强种子的选育和管理。遗传聚类分析结果显示，8个形态变异类型聚为4大类，综合分析可以看出，在遗传学上的分析结果与其外观形态特征大体上相似，即形态变异类型间有茎分枝多的聚在一起、茎分枝少的聚在一起、大叶的聚在一起、小叶的聚在一起的倾向，与茎皮颜色和花色没有关系。
本实验结果表明，利用遗传多态性分子标记的方法不仅可以揭示黄芩群体内遗传多态性以及亲缘关系，同时，也为优良品种选育提供了理论依据。在生产上，可以采用选择性育种的方法，优选单株进行系统研究，最终培育出高产、优质、高效的栽培品种。
【】
［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2005年版一部［S］.北京：化学出版社，2005：211.
［2］ 杨全,王文全,张卉,等.黄芩资源现状及可持续利用的研究［J］.时珍国医国药,2006,17(7):1159.
［3］ 肖丽和,王红燕,李发美,等.不同来源黄芩药材HPLC指纹图谱比较［J］.沈阳药科大学学报,2004,21(1):28.
［4］ 肖新月,张南平,符洪,等.黄芩的质量分析［J］.中药研究与信息,2003,5(2):17.
［5］ 杨全.甘草黄芩种内变异及选种基础研究［D］.北京中医药大学, 2007.
［6］ KIM C S, LEE C H, SHIN J S, et al. A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP［J］.Nucleic Acids Res,1997,25:1085.
［7］ 马小军,汪小全,肖培根.人参农家类型的AFLP指纹研究［J］.中药杂志,2000,25(12):707.
［8］ VOSS P, HOGERS R, BLEETER M, et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting［J］.Nucleic A Cids Res,1995,23: 4407.
［9］ 邵爱娟,李欣,黄璐琦,等.不同种源黄芩的RAPD分析［J］.中国中药杂志,2006,31(6):452.
