脑脉通有效部位中总生物碱的含量测定

                 作者：王淑美，冯素香，李淑芳，高淑娟,李建生

【摘要】  目的 建立脑脉通有效部位中总生物碱的含量测定方法。方法 采用酸性染料比色法，以溴甲酚绿缓冲液作为生物碱的显色剂，测定样品溶液在417 nm波长处的吸收度。 结果 对照品川芎嗪质量浓度在0.031～0.153 mg/mL的范围内与吸光度呈良好的线性关系,r=0.9998。平均回收率为100.95％，RSD为1.75％。精密度和稳定性良好。结论 酸性染料比色法灵敏、快速、准确，可用于脑脉通有效部位中总生物碱的含量测定。

【关键词】  脑脉通；总生物碱；酸性染料比色法

　　Abstract:Objective To establish a method for the determination of the content of total alkaloid in Nao Mai Tong recipe.Methods Acid dye colorimetry was used in the determination with bromocresol green buffer solution as the color developing agent with absorbance was determined at the detection wavelength of 417 nm.Results The calibration curve of the absorbance was linear with the concentration of ligustrazine in the range of 0.031～0.153 mg/mL(r=0.9998).The average recovery of ligustrazine was 100.95％,RSD=1.75%. Conclusion The method is accurate，sensitive,and can be applied to determine total alkaloid in Nao Mai Tong recipe.

　　Key words:Nao Mai Tong recipe；total alkaloid；acid Dye colorimetry

　　脑脉通由大黄﹑川芎﹑葛根等组成，具有解毒降浊﹑益气活血﹑涤痰开窍﹑泻下之功。该方脑梗死效果明显，可明显改善生活质量［1］，对脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用［2,3］。为有效控制脑脉通的质量，本文采用酸性染料比色法测定该制剂中总生物碱的含量［4］，方法简便、快速、准确性高、重现性好，为脑脉通的质量控制提供了可行的方法。

　　1  仪器与试药
    　　
　　METTLER-AE240型1/100000分析天平（瑞士梅特勒公司），RE52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），KQ-100型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，UV-2201SHIMADZU型分光光度计（日本岛津）。
    　　
　　大黄、川芎、葛根等药材购自河南省药材公司，经河南中医学院陈随清教授鉴定分别为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.的干燥根及根茎，豆科植物野葛Pueraria lobata(Wild.) Ohwi的干燥根，伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎。川芎嗪对照品（供含量测定用，批号：817-200104）购自药品生物制品检定所。其余试剂均为分析纯。
   
　　溴甲酚绿缓冲液的配制：精密称取溴甲酚绿125 mg，用0.2 mol/L的NaOH 12.5 mL溶解后，加入邻苯二甲酸氢钾2.55 g，加少量蒸馏水溶解后，转移至250 mL的容量瓶中，用蒸馏水稀释将至刻度，摇匀，0.2 mol/L的NaOH调pH4.8，备用。
   
　　脑脉通有效部位样品的制备：按照脑脉通处方比例称取药材粗粉，用10倍量Q%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并乙醇提取液，减压回收乙醇至无醇味，提取液用6倍量蒸馏水分散后，用大孔吸附树脂处理，P%乙醇洗脱至洗脱液约为树脂体积的8倍为止，即得有效部位样品。

　　2  方法与结果

　　2.1  溶液的制备
    　　
　　对照品溶液的制备：精密称取盐酸川芎嗪对照品6.10  mg至10 mL的容量瓶中，用三氯甲烷溶解并稀释至刻度，即得0.610 mg/mL的盐酸川芎嗪对照品溶液。
    　　
　　供试品溶液的制备：精密称取有效部位样品0.3 g，加少量的水使溶解，超声2 min，再加入25%的盐酸使溶液的pH值为2～3，用乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯层近无色，分取酸层，用氨水调溶液pH值9～10，再用三氯甲烷萃取5次（20，20，20，15，15 mL），合并三氯甲烷层，减压蒸干，三氯甲烷溶解转移至5 mL的容量瓶中，并稀释至刻度。
    　　
　　阴性样品溶液的制备：按处方比例分别称取除川芎外其他药材适量,按有效部位制备工艺制得缺川芎的阴性样品，按照供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。

　　2.2  测定波长的选择
   
　　精密吸取川芎嗪对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各1 mL分别置分液漏斗中，加入溴甲酚绿缓冲液7 mL和三氯甲烷10 mL振摇2 min，静置2 h,分取三氯甲烷层，并定容至10 mL。同法制得空白溶液。以空白为参比，400～700 nm范围内扫描测定吸收光谱，结果表明，样品与对照品均在417 nm处有最大吸收，故选择测定波长为417 nm。

　　图1  川芎嗪对照品溶液显色后吸收光谱（略）

　　Fig.1  UV Spectra of ligustrazine

　　图2  供试品溶液显色后吸收光谱（略）

　　Fig.2  UV Spectra of sample

　　图3  阴性样品溶液显色后吸收光谱（略）

　　Fig.3  UV Spectrum of negative sample

　　2.3  显色条件的考察

　　2.3.1  缓冲溶液pH值的考察  精密吸取供试品溶液6份，每份1 mL，置分液漏斗中，分别加入pH3.0、3.6、4.2、4.8、5.4、5.8 mL的溴甲酚绿缓冲液，按“2.2”项方法测定溶液的吸光度。结果表明，用pH值4.8的溴甲酚绿缓冲液显色，吸光度最大。

　　2.3.2  酸性染料用量考察  精密吸取供试品溶液5份，每份1 mL，分别加入溴甲酚绿缓冲液4、5、6、7 mL和8 mL，按“2.2”法测定吸光度。结果表明，溴甲酚绿缓冲液用量为7 mL时，已能使生物碱与其完全结合，被充分萃取，吸光度最大，再增加用量，反而会因空白溶液颜色加深，导致吸光度下降。

　　2.3.3  三氯甲烷用量的考察  精密吸取供试品溶液6份，每份1 mL，分别加入溴甲酚绿缓冲液7 mL，再分别加入三氯甲烷8、9、10、12、14、16 mL，剧烈振摇2 min，转移至分液漏斗中，静置2 h，分取三氯甲烷层，定容至10 mL,依法测定吸光度。结果表明，三氯甲烷的用量超过10 mL后，吸光度基本稳定。说明生物碱与酸性染料的配合物已基本萃取完全。

　　2.4  显色稳定性试验
    　　
　　取“2.2”项下显色后的供试品溶液，分别放置0、1、2、3、4 h后，于417 nm处测定吸光度，结果表明，三氯甲烷萃取液放置4 h内基本稳定，吸光度RSD为0.40%。

　　2.5  线性关系试验
   
　　精密吸取川芎嗪对照品溶液（0.61 mg/mL）0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL照“2.2”项下的方法于417 nm处测定吸光度。以川芎嗪对照品质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，得回归方程：C=0.2952A-0.0054（r=0.9998），表明川芎嗪在0.031～0.153 mg/mL的范围内与吸光度呈良好的线性关系。

　　2.6  精密度试验
    　　
　　精密吸取川芎嗪对照品溶液（0.61 mg/mL）1 mL，按“2.2”项方法于417 nm连续测定6次，记录吸光度，RSD为0.53%，表明仪器精密度符合要求。

　　2.7  重复性试验
    　　
　　取5份同一批有效部位样品约0.3 g精密称定，按“2.1”项方法处理供试品溶液，按“2.2”项方法显色后于417 nm处测定吸光度，并计算含量的RSD为2.67%，表明样品制备和测定误差符合要求，本实验方法重复性良好。

　　2.8  样品稳定性的考察
    　　
　　取有效部位样品约0.3 g，精密称定，按“2.1”项方法制备样品溶液，分别于显色后0、2、4、6、8、10 h后，依法测定吸光度，计算其含量，结果表明溶液在8 h内稳定，RSD为1.11%。

　　2.9  回收率试验
      
　　取5份同一批有效部位样品各0.15 g，精密称定，分别精密加入浓度为0.84 mg/mL的川芎嗪对照品溶液2 mL，低温干燥后，按“2.1”项方法制备样品溶液，再按“2.2”项下方法于415 nm处显色测定吸光度，计算其含量，结果总生物碱的平均回收率为100.95%，RSD为1.75%，结果见表1。

　　表1  总生物碱回收率试验结果（略）

　　Tab.1  Results of recovery test

　　2.10  样品的含量测定
   
　　取3批有效部位样品，每份约0.3 g，精密称定，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，最后定容至10 mL的容量瓶中。精密吸取供试品溶液1 mL，再按“2.2”项下方法于417 nm处显色测定吸光度，计算其含量，结果见表1。

　　表2  样品含量测定结果（略）

　　Tab.2  Contents of sample

　　3  讨论

　　3.1  酸性染料比色法是测定生物碱的常用方法之一 ［5］，可用于川芎药材总生物碱的含量测定。我们通过相关，采用溴甲酚绿缓冲液作为生物碱的显色剂，并对显色剂的用量及显色的稳定性等影响因素均做了考察，筛选出最佳方案，可以在一定程度上保证测定结果的重现、稳定和准确可靠。

　　3.2  在测定过程中发现阴性样品在422 nm处有干扰，将pH调节为酸性质，再分别用乙醚和乙酸乙酯萃取，结果乙醚萃取阴性仍有干扰，而乙酸乙酯萃取阴性无干扰。故选择乙酸乙酯为萃取溶剂。

　　3.3  建立了脑脉通有效部位中总生物碱的含量测定方法，3批样品的含量测定结果，脑脉通有效部位中总生物碱含量为1.09%～1.12%,转移率为75.19%～76.41％。

【参考文献】
  　　［1］ 李建生,郭明冬.脑脉通颗粒急性脑梗塞的临床疗效评价［J］.华中医药杂志,2005,20(9):563-565.

　　［2］ 任小巧,李建生,封银曼,等.脑脉通对老龄大鼠脑缺血/再灌注损伤脑保护作用的研究［J］.中药杂志,2004;29(1):66-68.

　　［3］ 李建生,高剑峰,周友龙,等.脑脉通对老龄大鼠脑缺血再灌注炎症级联反应变化的影响［J］.中国中药杂志,2006,31(21):1804-1807.

　　［4］ 何正有，刘 圆，贾敏如,等.奶芎、山川芎与川芎总生物碱的含量测定［J］.华西药学杂志，2004,19(4)：292-293.

　　［5］ 梁生旺.生物碱类成分分析［M］.北京:学苑出版社,1999：26.