复明片对兔视网膜脱离后视网膜色素上皮细胞增殖的影响

                    作者：刘娉，彭清华，李建超，彭抿，吴大力，张波涛，杨霞  

【摘要】  目的 研究复明片对兔实验性视网膜脱离后视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)增殖的影响。方法 用有色家兔96只设正常对照组（A组），制作视网膜脱离模型后分模型组（B组）、西药对照组（C组）、复明片组（D组）。并于造模后7、14、21 d分别取视网膜组织制备细胞悬液，流式细胞仪检测各兔增殖细胞核抗原(PCNA)在视网膜神经上皮层的表达。结果 脱离后视网膜神经上皮层PCNA 阳性细胞表达均呈上升趋势，7 d后开始下降，且复明片组相较其余各组比较均有统计学意义（P<0.05）。结论 复明片通过恢复视网膜色素上皮与神经上皮之间的接触，阻止RPE的增殖即PCNA的表达。

【关键词】  复明片；视网膜色素上皮细胞；增殖细胞核抗原；流式细胞仪；兔；黄芪；生地；茯苓

    〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ To study the effect of Fuming tablet on proliferation of retinal pigment epithelium (RPE) in rabbits' eyes with retinal detachment(RD). Method 96 healthy adult coloured rabbits were randomly divided into four groups: blank group(group A), model comparative group (group B), western medicine treating group(group C) and Fuming tablet treating group (group D). The cell suspensions were prepared with retinal tissues gained at 7th, 14th and 21th day after modeling, and the expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA) in retinal neurosensory layer was examined by flow cytometry(FCM). Result The expression of PCNA increased in the four groups after detachment, while it began to decrease after 7th day, and the expression in group D was significant than that in other groups(P<0.05). Conclusion Fuming Tablet can inhibit the expression of PCNA by the contact of both retinal neurosensory layer and retinal pigment epithelium layer was recovered by so was prevented.

    〔Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ〕 Fuming tablet; retinal pigment epithelium; proliferating cell nuclear antigen; flow cytometry; rabbits; Radix astragali; Rhizome of rehmannia; Poria cocos

    视网膜脱离(retinal detachment, RD)是指视网膜色素上皮与神经上皮之间的分离，是严重的致盲眼病，可导致眼球萎缩。在众多致盲因素中占第5位，14岁以下儿童占第4位[1]。视网膜脱离手术后的解剖复位率达95％以上，但术后视功能恢复仍不理想。目前，尚缺乏能应用于临床的有针对性的药物。寻求能改善视网膜脱离手术后增进患者视功能的辅助，是临床上亟待解决的问题。

    1 材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物  成年健康有色家兔96只，体质量2.0～2.5 kg，雌雄各半，由湖南中医药大学实验动物中心提供。动物合格证号：医动字第20-003号。

    1.1.2  药品  复明片：由黄芪、生地、茯苓、车前子、地龙、赤芍、红花、白术等中草药按制剂制备工艺制成，0.3 g/片，选用同一批号药物，批号：040208。由湖南中医药大学第一附属药剂科提供。使用时去掉糖衣，研成粉末，温开水混合，配制成浓度为10%的混悬液；三磷酸腺苷二钠片(Adenosine Disodium Triphosphate Tablets, ATP)：20 mg/片，福建古田药业有限公司生产，批号：050827-1；维生素B1(Vitamin B1，VitB1)：10 mg/片，湖北华中药业有限公司生产，批号：20050801；维脑路通：60 mg/片，山西晋新药业集团有限公司生产，批号：050811，使用时研成粉末，温开水混合，配制成每升水含VitB1 1 276 mg、 ATP 1 102 mg、维脑路通734 mg的溶液；透明质酸酶：上海第一生化药研所生产，批号：20050901。

    1.1.3  仪器  OPTON多功能显微镜（德国OPTON公司生产）；Olympus光学显微镜（日本OLYMPUS公司生产）；双目间接眼底镜（美国Welch Allyn公司生产）；Topcon眼科手术显微镜（日本TOPCON公司生产）；眼底接触镜（苏州医疗器械有限公司生产）；eppend-orf 5804R/5810R型高速冷冻离心机（德国SIGMA公司生产）；Beckman coulter流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司生产）。

    1.1.4  试剂  PCNA测试盒（武汉博士德生物工程有限公司生产）；DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司生产）。

    1.2  方法

    1.2.1  兔眼视网膜脱离模型建立  依照[2]等提出的方法，并加以改进。术前3 d用0.25％氯霉素眼药水和1％阿托品眼药水交替滴眼，3次/d。手术当日生理盐水冲洗结膜囊，术前滴1％丁卡因眼药水2~3次。造模时术眼（均取右眼）采用10%新福林和1%阿托品散瞳。3%戊巴比妥耳缘静脉注射(1 mL/kg)麻醉后，将兔固定于手术台上，庆大霉素加生理盐水混合液冲洗结膜囊，常规消毒铺巾、开睑。点丁卡因表面麻醉，方筋膜下注入2％利多卡因0.2 mL形成泡状隆起，沿角膜缘环行剪开鼻侧球结膜和筋膜，向后稍分离，暴露赤道部巩膜，距角巩缘后5 mm睫状体平坦部用25GB-D针头垂直眼球壁刺穿巩膜，在眼底接触镜和显微镜直视下观察到伸入玻璃体内的针尖，将10 IU/mL透明质酸酶溶液0.1 mL缓慢注入到玻璃体的中央偏后部，拔针后压迫注射点3 min。15 min后再由原穿刺口将自制视网膜下腔注射针头缓慢探进，反复抽吸0.1 mL液化的玻璃体，在眼底接触镜和显微镜直视观察下小心地把针尖引向后极部， 避开视网膜血管，在颞侧距视乳头1个视盘直径(Papilla Disc, PD)放射状视网膜处刺穿视网膜，进入视网膜下腔，助手缓慢推动注射器，注入液化的玻璃体液0.1 mL，可见视网膜被分离，脱离的视网膜呈大片灰白色隆起，范围约1/2个PD大小，退出针头，角膜缘处放出房水以降低眼内压。术后铺平球结膜，结膜囊涂0.5%四环素眼膏，结膜下注射庆大霉素加地塞米松0.1 mL，肌肉注射庆大霉素0.8万u，以防感染，术后1周每天用氯霉素眼药水点眼4次，并一直给1%阿托品眼液散瞳。

    1.2.2  给药方法  造模后第1天下午开始给药，A组（正常对照组）与B组（模型对照组）均予温开水灌胃，5 mL/kg，每日1次；C组（西药对照组）予西药混合溶液灌胃，5 mL/kg，每日1次；D组（复明片治疗组）予复明片混悬液灌胃，5 mL/kg，每日1次。

    1.2.3  标本制备、细胞悬液制备方法及流式细胞检测  于造模后7、14、21 d，各兔用3%戊巴比妥耳缘静脉注射(1 mL/kg)麻醉，摘除眼球，生理盐水冲洗干净。在冰生理盐水中，沿角巩缘剪开眼球达360度，弃角膜、晶体、玻璃体，保留视网膜连同脉络膜巩膜组织，取出视网膜于定量滤纸上加少许0.01M PBS(pH 7.2~7.6)液，用显微剪均匀剪碎，制备细胞悬液，75%乙醇固定，4 ℃冰箱保存备用。收齐样本后取细胞悬液1 000 r/min离心7 min，弃上清后加入75%乙醇混匀固定。测试当日加含10%的胎牛血清1 mL室温下放置20 min后0.01M磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗2次，每次3 min，1 000 r/min离心7 min，弃上清。阳性组加入PCNA 1∶50配比50 μL每管，阴性对照组加PBS液50 μL每管，4 ℃过夜。0.01M PBS洗3次，每次5 min，1 000 r/min离心7 min，弃上清。1∶200异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate，FITC)标记二抗，室温孵育2 h，0.01 M PBS洗3次，每次5 min，1000 r/min离心7 min，弃上清。加入0.01M PBS 800 μL，应用FACSCalibur型（Becton Dickinson公司）流式细胞仪检测PCNA阳性细胞百分数。每次检测都设有空白对照及正常对照，每时间点检测3~5次，取平均值。

    1.3  统计方法

    用SPSS11.5统计软件包进行统计学处理，所有实验数据以均数标准差(ｘ±ｓ)表示。

    2 结果

    脱离后视网膜神经上皮层PCNA阳性细胞表达均呈上升趋势，7 d后开始下降。7 d时模型组、西药对照组、复明片组、正常对照组各组间差异均有统计学意义；14 d时除复明片组与西药对照组其余各组比较差异均有统计学意义；21 d时除复明片组与正常对照组及复明片组与模型组外，其余各组比较差异均无统计学意义。见表1。

    3 讨论

    3.1  中医对视网膜脱离的认识及治疗

    在祖国医学文献中无“视网膜脱离”病名，根据其临床表现，可归属于“暴盲”、“神光自现”等范畴，为“外不见证，从内而蔽”的内障眼病。中医文献上的某些记载，与本病颇为相似，如《证治准绳·七窍门》中：“谓目外自神光出现，每如电光闪掣，甚则如火焰霞明，时发时止，……乃神光欲散，内障之重者”；《抄本眼科》“落气眼”一症：“忽然眼目黑暗，不能视见，白日如夜，此症乃元气下陷，阴气上升”；《目经大成》也有“电光夜照”症状的记载。传统中医学认为,视衣(视网膜) 为瞳神深部组织, RD属内障眼病,属于瞳神疾病范畴；瞳神称水轮,在脏属肾,视网膜是大脑的延伸部分,肾生髓于脑,故视网膜的病变与肾密切相关。肝胆互为表里,肝肾同源,肾藏精而肝藏血,目得精血之养才能视觉灵敏,故肝肾不足,精血亏虚,常为视网膜病的重要病因病机;又肝主疏泄,肝郁则气滞,气滞则血瘀,视网膜病变亦常与此有关;脾为后天之本,气血生化之源,主运化水湿,脾虚气血不足,目失所养或水湿上泛是视网膜发生变性、水肿、渗出或增殖的重要病机。故视网膜、玻璃体的病变与肝、胆、肾、脾等脏腑功能密切相关[3]。视网膜脱离产生之原因，多为患者气虚不固致视网膜不能紧贴球壁而脱落；而视网膜脱离手术是一种人为的眼外伤，术后多有瘀血病理存在，有时术中还可致视网膜出血；本病术中无论放水与不放水，其术后多有网膜下积液存留；而术中不可避免之出血又可使眼部阴血亏虚。

    中医眼科历来重视围手术期的药物，尤注重手术后用药。在RD的治疗上，目前一般主张中西结合，在RD围手术期应用中医中药，如术前应用补肺生津兼以利水方，术后应用滋养肝肾、益气养阴兼以活血化瘀方[3]；或服用具有调理补益、活血化瘀渗湿功用的中药；或配合散结通络，活血明目中药RD2号方口服；或采用和营清热、温阳利水法中药治疗；或应用中药RD1号方(利水方剂)联合皮质内固醇治疗，或针刺疗法改善实验性RD视网膜组织中PKC的活性、及提高兔眼环扎术后房水氧含量，均可以促进术眼的恢复，防治手术并发症[4]。

    3.2  活血利水之复明片对RPE细胞PCNA表达的影响

    近年研究结果提示，网脱后视细胞外节变性、视细胞凋亡及不完全再生是术后视力恢复不良的主要原因。视网膜色素上皮与神经上皮之间的分离,导致RPE细胞的直接暴露，RPE细胞在各种细胞因子、生长因子等的作用下开始增殖，同时Müller细胞亦启动增殖，RPE细胞及Müller细胞的增生、肥大不仅填充了视网膜中死亡的光感受器细胞留下的空缺，Müller在视网膜内层中的数目和大小也增加，这些细胞有在视网膜下空间生长并形成巨大瘢痕的倾向性，从而完全阻碍了外节的再生[5]，阻碍视功能的恢复，并促进PVR的形成。赵明威等[6]研究发现RPE 细胞对FN的吞噬受细胞内PKC、TK和PI 32K信号传导通路的调节，增殖的RPE细胞吞噬功能下降，影响其对感光细胞的代谢作用，也即影响视功能的恢复。则是一种细胞DNA 合成和细胞周期进程中的必要蛋白,它最早表达在G1期,峰值在S期,以后在G2期和M期呈弱表达[7]。Grierson等[8]认为在正常RPE细胞层，大多数细胞间彼此紧密接触具有协同作用,处于“接触抑制”状态。当局部产生损伤时, 与损伤区毗邻的细胞相互孤立, 细胞间的协同作用丢失, 并且与来自周围损伤组织的信号发生反应。细胞运动和增殖的接触抑制被打破, 以致于最终进入细胞周期开始增殖。当视网膜复位后，RPE细胞恢复原有的协同作用，重建细胞间的平衡，接触抑制恢复，RPE细胞的增殖逐渐停止。另有研究认为各种生长因子及其受体、细胞外基质（ECM）及其整合素受体和基质金属蛋白酶及其抑制物等相互作用维持细胞生长的平衡调控的[9]。在正常情况下, 某些特殊的ECM对RPE 细胞的增殖存在负调控作用[10]，从而抑制了RPE细胞增殖。

    本实验结果显示,空白组PCNA表达很低,模型组PCNA表达明显增高,其余各组眼内的含量也明显高于空白组,而活血利水治疗组PCNA表达明显较模型组低,亦低于西药对照组,说明活血利水法治疗(用复明片)在抑制PVR过程中起作用。

    复明片以益气养阴、活血利水为原则，用补阳还五汤为主益气活血，加茯苓、车前子、泽泻益气利水消肿；生地、女贞子、旱莲草补养阴血。前期临床研究显示用于治疗网脱术后视力减退患者，对提高视力有较好的效果(有效率为95.45%)，且经追踪观察，其疗效巩固[11]。

    方中选用黄芪大补脾胃之元气，令气旺血行，瘀去络通；地龙、赤芍、红花活血祛瘀通络；白术健脾益气、利水；车前子、茯苓配伍生地使其利水而不伤阴。本方补气药与活血药相配，使气旺则血行，共奏益气活血利水而不伤正之功。药研究表明两类药合用具有抗炎、促进免疫功能、延缓衰老、减少自由基的生成并促进其清除，及抑制血小板钙调蛋白而使磷酸二酯酶的活性下降，使血小板内cAMP含量增加而明显抑制血小板的聚集，扩张血管，抗血凝，从而促进视网膜血液循环，改善能量代谢，增强组织的抗氧化能力，减轻自由基对组织的损伤，还具有和醛固酮及其拮抗剂相似的结构而具有利尿、抗癌等作用。合方利水药促进视网膜下液吸收，益气、活血、养阴可恢复正气均可使视网膜色素上皮与神经上皮之间恢复接触，从而阻止RPE的增殖即PCNA的表达。

【】
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