Caspase?3在白色和杂色豚鼠脉冲噪声损伤耳蜗中的表达

                   作者：何青莲 熊敏 李云英 石灵春 谭敏 李华

【摘要】  【目的】观察Caspase?3在暴露于脉冲噪声中的白色和杂色豚鼠耳蜗中的表达，以探讨黑色素对耳蜗损伤的保护作用机制。【方法】选用白色和杂色豚鼠各8只，暴露于脉冲噪声中复制耳蜗损伤模型。取耳蜗用石蜡包埋、切片，采用免疫组织化学法观察Caspase?3在两组豚鼠耳蜗的表达。【结果】Caspase?3在两组脉冲噪声暴露豚鼠耳蜗中均呈阳性表达，以血管纹和螺旋神经节的表达较强，而且Caspase?3在白色豚鼠耳蜗的表达显著强于杂色豚鼠。【结论】耳蜗黑色素拮抗耳蜗损伤的作用是通过抑制耳蜗Capase?3活性，从而抑制耳蜗细胞的凋亡来实现的。

【关键词】  耳蜗疾病； 耳蜗/病； 细胞凋亡； 黑色素； 疾病模型，动物； 豚鼠

    研究表明，黑色素对杂色豚鼠耳蜗的噪声损伤有保护作用［1］，但其抗损伤机制尚不完全清楚。细胞凋亡是耳蜗损伤的一种重要机制，而细胞凋亡是受细胞内源性基因、酶类和信号传导途径调控的一个"瀑布式"激活过程［2］，Caspase家族（又称天冬酰胺特异酶切的半胱胺酸蛋白酶家族）是一切凋亡信号传导的共同通路，正由于此家族的激活最终导致内源性核酸酶的激活和细胞骨架重新组合所致的细胞结构解体，形成不可逆的凋亡［3］。Caspase家族现有13名成员，其中Caspase?3由于其具有的凋亡执行作用而成Caspase家族中的核心成员［4］，它的表达意味着细胞在发生凋亡。本研究应用免疫组织化学方法检测并比较Caspase?3在白色和杂色豚鼠耳蜗的表达，以探讨耳蜗黑色素是否通过影响Caspase?3活性而对耳蜗脉冲噪声损伤起拮抗作用。现报道如下。

    1  材料与方法

    1.1  动物  采用健康白色红目豚鼠和杂色豚鼠各8只，耳镜检查鼓膜正常，耳廓反射灵敏。豚鼠来源于广东省医学实验动物中心，3月龄，体质量250g左右，合格证号：0017410。

    1.2  主要试剂与仪器  抗Caspase?3抗体（BA0588）、链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物（SABC）免疫组化试剂盒（SA1022）均为Sigma公司产品；86式自动步枪来源于广东省军区军训靶场；Pathfinder I 型听功能测试仪（Nicolet）。

    1.3  造模方法［5?6］  脉冲噪声发生源为86式自动步枪，脉冲噪声发生环境为军训靶场，将豚鼠置于距步枪口15cm处，测得该处声压为170dB。步枪连续激发6发，每次激发间隙10s。

    1.4  听觉脑干诱发电位（ABR）检测  ABR阈值采用Pathfinder I型听功能测试仪记录，短声刺激，声音由耳机通过与豚鼠外耳道耦合的塑料小管输入，以第3波为基准反应阈，测定两组豚鼠造模前及造模后24h的听阈值。

    1.5  取材  最后1次检测ABR后，豚鼠在全麻下开胸，以磷酸盐缓冲液（PBS）心脏灌流，在灌流液清亮时，改用40g/L多聚甲醛灌注固定5min。迅速取下双侧颞骨，将耳蜗置于4℃、40g/L多聚甲醛液中，在解剖显微镜下摘除镫骨，用细针于蜗顶钻1小孔，轻轻以40g/L多聚甲醛灌流耳蜗，耳蜗在多聚甲醛中固定12h以上，PBS漂洗数次，100g/L乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙，石蜡包埋，切片，每片厚度6μm。

    1.6  Caspase?3表达检测  采用免疫组织化学染色法。两组豚鼠耳蜗切片以二甲苯及酒精脱石蜡后，Tris缓冲盐溶液（TBS）漂洗10min×3次，体积分数2%双氧水处理20min；TBS漂洗10min×2次，2g/LTriton?X处理10min；TBS漂洗10min×3次，50g/L胎牛蛋白封闭60min；加抗Caspase?3抗体（以8g/L胎牛蛋白稀释为1∶600），在4℃冰箱过夜；加入二抗（羊抗兔，用TBS稀释为1∶400）1h，TBS漂洗后加入链球菌过氧化物酶（Strep?HRP，用TBS稀释为1∶100）1h，TBS漂洗10min×4次后，用二氨基联苯胺（DAB）显色液显色，显色在光镜下控制进行。阴性对照以8g/L胎牛蛋白代替抗caspase?3抗体，以庆大霉素损伤豚鼠肾脏切片为阳性对照。

    1.7  统计学方法  采用SPSS11.5软件进行统计学分析。

    2  结果

    2.1  两组豚鼠ABR听阈变化比较  由表1可知，两组豚鼠在脉冲噪声暴露后ABR听阈比较具有显著性差异（P＜0.01），杂色豚鼠的平均听阈比白色豚鼠约低17dB左右。 表1  两组豚鼠ABR听阈变化比较 统计方法：t检验；①Ｐ＜0.01，与杂色组比较

    2.2  Caspase?3在耳蜗的表达  Caspase?3在两组豚鼠耳蜗反应均呈阳性，阳性区域主要位于耳蜗血管纹和螺旋神经节，而且在耳蜗的各转都呈阳性，Caspase?3在白色豚鼠耳蜗的表达明显强于杂色豚鼠。在Corti 氏器，支持细胞如：Hensen 细胞、Deiter 细胞、内外柱细胞、边缘细胞Caspase?3 反应呈弱阳性；感觉细胞（内、外毛细胞）Caspase?3 染色亦呈弱阳性，外毛细胞染色较内毛细胞稍强。蜗神经的Caspase?3 染色在光镜下呈阴性。Caspase?3 在血管纹和螺旋神经节细胞的表达呈强阳性，且其表达在白色豚鼠（图1-a,b）和杂色豚鼠（图1-c，d）差异显著。Caspase?3 在两组豚鼠耳蜗的表达强度见表2，并对Caspase?3 的表达强度以＋～＋＋＋表示进行半定量分析［7］。 表2  两组豚鼠Capase?3耳蜗表达比较统计方法：秩和检验；①Ｐ＜0.05，与杂色组比较

    3  讨论

    噪声能导致耳蜗的损伤，其损伤包括机械性和代谢性两种机制，一般认为先有机械性损伤，之后继发代谢性损伤。杂色豚鼠耳蜗黑色素能拮抗噪声对耳蜗的损伤作用，但是黑色素拮抗耳蜗损伤的作用机理不清楚。研究证实Caspase?3 在正常的耳蜗中不表达，但Caspase?3 是参与噪声耳蜗损伤的主要病理因素之一［8］。本研究结果表明Caspase?3 在脉冲噪声损伤耳蜗中表达阳性，尤以血管纹和螺旋神经节细胞为甚，而且Caspase?3 在杂色豚鼠耳蜗的表达强度显著低于白色豚鼠耳蜗的表达强度，表明杂色豚鼠耳蜗黑色素可能通过代谢途径抑制Caspase?3 活性，从而拮抗豚鼠耳蜗的损伤。

    Caspase?3 是近年来发现的类半胱氨酸蛋白酶家族成员之一。Caspase?3 是细胞凋亡中的关键蛋白酶，它单独或协同参与水解许多与凋亡有关的蛋白质［9］。正常情况下，Caspase?3 以无催化活性的酶原形式存在于细胞质内，不危害细胞。但当细胞进入凋亡过程时，Caspase?3 则经由特异的Asp残基处的蛋白水解作用而被激活，从而产生了蛋白水解作用形成的Caspase?3 自我放大级联反应［10］，进而裂解DNA损伤细胞。Caspase?3 阳性表达意味着细胞凋亡在进行过程中。本实验结果观察到Caspase?3 在脉冲噪声损伤耳蜗的血管纹和螺旋神经节细胞表达阳性，预示着耳蜗血管纹和螺旋神经节细胞发生凋亡，提示细胞凋亡在脉冲噪声耳蜗的损伤中起重要作用。而Caspase?3 在白色豚鼠耳蜗的表达强度显著强于杂色豚鼠，意味着白色豚鼠耳蜗细胞凋亡数目显著多于杂色豚鼠。白色豚鼠和杂色豚鼠耳蜗血管纹均存在黑色素细胞，但是它们的区别是白色豚鼠的黑色素细胞不产生黑色素［11］。是否杂色豚鼠耳蜗血管纹黑色素细胞通过分泌黑色素抑制耳蜗细胞的凋亡，从而对噪声损伤起拮抗作用，有待进一步研究证实。

【】
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［4］黄伟.Caspase 研究进展［J］.国外医学：输血学及血液学分册，2001，24（4）：292.

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［7］于萍，步宏，王华，等.免疫组化结果的图像分析与人工计数方法的对比研究［J］.生物医学工程杂志，2003，20（2）：288.

［8］汪建，熊敏，何青莲，等.Caspase 3在豚鼠噪声损伤耳蜗中的表达［J］.广东医学，2005，26（1）：46.

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