5?氮杂胞苷对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖及成肌分化的影响

                作者：陈凯佳 刘小斌 邱仕君 周健洪 肖莹

【摘要】  【目的】观察5?氮杂胞苷（5?Aza）对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）体外增殖和成肌分化的影响。【方法】无菌条件下取SD大鼠骨髓组织，采用密度梯度离心法分离大鼠MSCs，传3代后的MSCs采用双标免疫组化法鉴定后，随机分为4组：浓度为5、10、15μmol/L的5?Aza组和空白对照组，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测不同浓度5?Aza对MSCs生长增殖的影响；以含5、10、20μmol/L5?Aza的培养基诱导培养MSCs 24 h后，改用完全培养基继续培养，采用免疫组织染色法鉴定5?Aza诱导分化3、7、14d后细胞肌分化相关蛋白肌凝蛋白（myosin）和结蛋白（desmin）的表达情况。【结果】双标免疫组化染色结果显示：所培养细胞同时表达Brdu和CD44、CD54，表达率达96%，鉴定结果表明所培养细胞为MSCs；5、10μmol/L5?Aza对MSCs增殖无显著影响（P＞0.05），15μmol/L5?Aza可显著抑制MSCs生长（P＜0.05）；不同浓度5?Aza诱导培养MSCs后第3天，部分细胞出现desmin阳性表达，诱导后14d，部分细胞表达myosin，以10μmol/L5?Aza组作用为佳。【结论】高浓度5?Aza可抑制MSCs体外增殖；适宜浓度的5?Aza可诱导MSCs向成肌细胞定向分化。

【关键词】  骨髓间充质干细胞/病； 5?氮杂胞苷/药理学； 细胞培养，体外的； 蛋白表达

    骨髓间充质细胞（MSCs）是干细胞中的一种，主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富。MSCs具有易分离、扩增以及体外操作简便等特点，能在一定的诱导条件下向成肌细胞分化［1］。本研究观察5?氮杂胞苷（5?Aza）对大鼠MSCs增殖与成肌分化的影响。现报道如下。

    1  材料与方法

    1.1  动物  纯种SD大鼠，SPF级，4周龄，体质量90～130g，用于MSCs的提取。由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号：粤鉴证字2005A031SCX（粤）2003?0001。

    1.2  主要试剂与仪器  IMDM培养基、特级胎牛血清（FBS）为美国GIBCOL公司产品；链霉亲和素生物素复合物（SABC）、二氨基联苯胺（DAB）染色试剂盒、抗体CD54、增殖细胞核抗原（PCNA）、生物素化二抗（羊抗小鼠）、DAB显色剂、5?溴?4?氯?3?吲哚?磷酸/氮蓝四唑盐（BCTP/NBT）显色剂均为武汉博士德公司产品；四甲基偶氮唑盐（MTT）、5?溴脱氧嘧啶（Brdu）及其单克隆小鼠抗体均为SIGMA公司产品；5?氮杂胞苷（5?Aza）、D?Hank?s液、Tris盐缓冲液（TBS）、磷酸盐缓冲液（PBS）、20g/L台盼蓝染液、2.5g/L胰酶、马血清均由广州威佳公司提供；鼠抗人肌凝蛋白（myosin）、鼠抗人结蛋白（desmin）为武汉博士德公司产品；BB36UU型CO2培养箱为德国Heraeus公司产品，设置37℃、CO2浓度为体积分数5%；CHK2?F?GS型显微镜为日本OLYMPUS公司产品；XDS?IB型倒置显微镜为重庆光电产品；PE?1420多功能微板分析仪为上海Perkin Elmer产品；超净台（PURIFIATION EPUIPMENT）为苏州净化设备有限公司产品；TGL?16G型离心机为上海安亭产品；YH140?1型电热恒温水箱为广州东方产品。

    1.3  MSCs分离及体外扩增  取4周龄SPF级SD大鼠4只，100g/L水合氯醛腹腔注射以麻醉动物。无菌条件下取双股骨及胫骨，收集骨髓腔内组织细胞，将细胞悬液分装，2000r/min×20min密度梯度离心2次，收取单核细胞层，加入IMDM培养液，打散成细胞悬液。细胞悬液用20g/L台盼蓝染液染色，计数300个细胞，调整密度，染色蓝色的死细胞小于5%方可继续实验，计数板计数，按1×104个/瓶密度接种于75cm2培养瓶上，置于37℃、体积分数5%饱和湿度的CO2培养箱中培养，2d后半量更换培养液，弃去未贴壁细胞。以后每3d换液1次，细胞培养7～10d后细胞密度较高，达90%融合后，弃去培养液，加入D?Hank?s缓冲液进行冲洗，2.5g/L的胰蛋白酶37℃条件下消化5～10min，镜下观察消化控制时间，当细胞形态开始变化、变圆、漂浮、脱壁，立即加入血清终止消化反应。常规按1∶2或1∶3比例传代。

    1.4  双标免疫组化法检测  传3代后的细胞种入装有IMDM空白培养基的24孔板中，24h后固定；0.01mol/LTBS洗10min+5min，体积分数3%H2O2洗涤10min，蒸馏水洗2min×3次，正常山羊血清封闭20min，用去多余液体，一抗用多克隆兔抗，CD44、CD54（1∶100）4℃过夜（对照组不加一抗，加TBS），0.01mol/LTBS洗2min×3次，生物素化羊抗兔37℃、40min，TBS洗2min×3次，SABC?AP37℃、40min，TBS洗5min×4次，BCTP/NBT显色30min，双蒸水洗2min×3次。双标阻断液30min，0.01mol/LTBS洗2min×3次，正常山羊血清封闭20min，一抗用小鼠单克隆抗体（Brdu）1∶100于37℃、3h（对照组不加一抗），0.01mol/LTBS洗2min×3次，生物素化羊抗小鼠IgG37℃、40min，0.01mol/LPBS洗2min×3次，SABC试剂37℃、40min，0.01mol/LTBS洗5min×3，DAB显色30～40min。中性树胶封片。

    1.5  MTT法细胞活性检测  制备单细胞悬液，计数，调整细胞浓度1×105/mL，接种于96孔板，1×103个细胞/孔，每孔容积200μL，实验组浓度分别为5?Aza5、10、15μmol/L，空白对照组为完全培养基。各组同时培养达72h后每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，继续在37℃培养箱内孵育4h，去上清，然后每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，振摇10min，采用PE?1420多功能微板分板仪于490nm波长处测光吸收值（D），以绘制增殖曲线。

    1.6  5?Aza诱导MSCs分化  MSCs传至第3代时，按1.0×103个/孔，接种于预置盖玻片的24孔细胞培养板中，用IMDM完全培养基培养（1mL）；接种24h后，去除非贴壁细胞，分别改用含有IMDM完全培养基1mL以及含5?Aza5、10、20μom1/L的诱导培养基继续培养24h，去除培养基，以PBS充分洗涤，改用完全培养基培养；对照组始终采用完全培养基培养，不加药物。

    1.7  免疫细胞组化分析  诱导分化3、7、14d后终止培养，取出盖玻片，PBS漂洗，40g/L多聚甲醛固定，体积分数3%过氧化氢封闭5～10min，滴加羊血清，室温封闭30min弃去，分别加入一抗工作液（myosin、desmin），4℃过夜，0.01mol/L的PBS洗涤液洗涤，滴加生物素标记羊抗小鼠IgG，DBA显色，或加用苏木素复染，中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗，试验对照用未诱导的细胞爬片进行染色。观察诱导后细胞肌分化相关蛋白（myosin、desmin）表达的情况，并与阴性对照组及实验对照组进行比较。

    1.8  统计学方法  所得数据用SPSS11.5软件进行统计。

　　2  结果

    2.1  MSCs的分离与培养  传3代后的MSCs细胞，在空白对照组（图1-a）及实验组中均可生长，在5?Aza培养基中生长较缓慢（图1-b），其中15μmol/L5?Aza组细胞培养3d后大部分死亡。

    2.2  MSCs双标免疫组化染色结果  镜下可见，未使用CD44、CD54、Brdu标记的细胞未被染色，镜下为透明的细胞（图2-a），用CD44、CD54单标并经BCTP/NBT染色，再经Brdu双标DAB复染后的MSCs细胞表面被染成蓝色，细胞核被染成棕黄色，表达率达96%以上（图2-b），表明所培养细胞的确是MSCs细胞。

    2.3  5?Aza对MSCs增殖的影响  表1结果显示，5、10μmol/L的5?Aza组与空白对照组比较无显著性差异（P＞0.05），15μmol/L的5?Aza组与空白对照组比较差异有显著性意义（P＜0.05）。表明5?Aza浓度过高时，会对MSCs生长产生抑制作用。

    2.4  免疫组化检测结果  应用不同浓度5?Aza诱导MSCs24h，再换成完全培养基,诱导后的第3天,部分细胞出现desmin阳性表达（图3?a）,诱导后14d,部分细胞表达myosin（图3?b），阳性细胞主要见于10 μmol/L 5?Aza组，未经诱导的细胞myosin及desmin表达均呈阴性（图3?c）。表1  5?Aza与完全培养基对MSCs增殖作用比较

    3  讨论

    CD44和CD54是MSCs的重要标志物，它们属于细胞粘附分子，介导细胞间、细胞与细胞外基质间的相互作用。Brdu是一种胸腺嘧啶类似物，在DNA合成时可被细胞摄取利用而参与DNA组成，利用Brdu标记技术可以观察MSCs的分裂增殖情况，表明所培养的是具有分裂和增殖能力的MSCs。本文免疫细胞双标化学染色结果显示，所培养的细胞同时表达Brdu和CD44、CD54，表达率达96%以上。低浓度5?Aza对MSCs的增殖作用不明显，5、10μmol/L5?Aza组与空白对照组比较无显著性差异；当浓度增高，达15μmol/L时，对MSCs生长开始产生抑制作用，表明5?Aza浓度过高时，会对细胞产生毒性。［1］报道5?Aza对MSCs生长的促进作用在培养15d后才比较明显，作用浓度为5、10μmol/L。本实验由于时间和条件的限制，MTT检测的细胞培养时间均为3d，有待于以后继续完善。

    骨髓间充质干细胞（MSCs）的分化是一个极其复杂的过程，受到诸多调节细胞分化的基因调控，成肌细胞分化受到MyoD、Myf5、myogenin、MRF4等基因调控， MSCs分化是在多个转录因子的共同调控下进行的［2］。在肌分化过程中,首先是成肌细胞的定向分化,紧接着是myosin和desmin的表达,它们都是骨骼肌最早的成肌标志之一。同时，myosin和desmin分别是微丝和中间丝家族中代表肌分化的成员［3］。desmin是新生/成熟平滑肌、心肌、骨骼肌细胞中间肌丝的主要构成成分之一,其在心肌和骨骼肌均呈阳性表现，而成纤维细胞中没有表达。因此myosin与desmin的表达常用于MSCs向成肌方向分化的实验中。本实验应用5?Aza对已传3代的MSCs进行诱导分化，结果经desmin、myosin抗体染色部分出现阳性反应，以10μmol/L浓度组为佳。表明一定浓度的5?Aza可以促使骨髓间充质干细胞向成肌方向转化。

【文献】
  ［１］ 王劲,郭朝华,张勇,等.5?氮杂胞苷诱导间充质干细胞分化为成肌细胞的实验研究［J］. 中华创伤杂志,2003,19(4):207.

［2］ 林先和,李隆.5?氮杂胞苷诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化过程中PPARγ表达及其作用［J］.第三军医大学学报,2004,26(6):526.

［3］Jennings CG. Expression of the myogenic gene MRF4 during xenopus development［J］. Dev Riol,1992，151:319.