安心颗粒对心衰大鼠血清TNF?α、IL?6及心肌细胞凋亡的影响
【摘要】 【目的】观察安心颗粒对慢性心力衰竭（CHF）模型大鼠血清肿瘤坏死因子?α（TNF?α）、白细胞介素?6（IL?6）水平及心肌细胞凋亡的影响。【方法】将50只雌性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、卡托普利组、安心颗粒低剂量组和安心颗粒高剂量组。采用阿霉素腹腔注射造模，每周1次，连续6周。造模同时，卡托普利组及安心颗粒低、高剂量组分别按６.２５mg·kg-1·d-1、0.8g·kg-1·d-1、1.6g·kg-1·d-1剂量灌胃给药。造模结束后,分别测定各组血清TNF?α、IL?6水平与心肌细胞凋亡指数（Ｉ凋亡）。【结果】 模型组血清TNF?α、IL?6水平及Ｉ凋亡均显著性升高（Ｐ＜０.０５）；安心颗粒低、高剂量组均可显著性降低模型大鼠血清ＴＮＦ?α、ＩＬ?６水平及Ｉ凋亡（Ｐ＜０.０５或Ｐ＜０.０１），且呈现一定剂量效应关系。【结论】安心颗粒可通过调控炎性细胞因子,抑制心肌细胞凋亡,阻止心力衰竭的。
【关键词】 安心颗粒／药 心力衰竭 慢性／中药疗法 细胞凋亡 细胞因子 心肌／病理学 疾病模型 动物 大鼠
研究表明心力衰竭时有广泛的心肌细胞凋亡存在,心肌细胞凋亡发生参与了心力衰竭的心肌重塑,并在心力衰竭的发生、发展中起重要作用［1］。炎症细胞因子可诱导心肌细胞凋亡、促进心肌重构而促使心力衰竭恶化［2］。因此，以抑制炎性细胞因子和心肌细胞凋亡为靶向的生物学干预，是心力衰竭的一个有效途径。本文旨在通过建立阿霉素性心力衰竭大鼠模型，探讨肿瘤坏死因子?α（TNF?α）、白细胞介素?6（IL?6）与细胞凋亡的关系及中药安心颗粒的作用机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 药物与试剂 安心颗粒（由人参、桂枝、瓜蒌壳、水蛭、茯苓等组成，含生药4.5g/g）由培力（南宁）药业有限公司提供（批号：050301）；卡托普利由中美上海施贵宝制药有限公司生产（批号：0505031）；盐酸阿霉素粉针由深圳万乐药业有限公司生产（批号：0501E2）。TNF?α、IL?6试剂盒购于北京Solarbio公司；原位细胞凋亡试剂盒由Roch公司生产。
1.2 动物 清洁级雌性SD大鼠50只，体质量160～180g，由广西中医学院实验动物中心提供（合格证号为桂医动字11003）。
1.3 模型复制［３］ 将注射用盐酸阿霉素粉针用灭菌注射用水溶解，用9g/L生理盐水配成0.8mg/mL溶液，第1～3周按3mg/kg剂量给模型组和用药组大鼠进行腹腔注射，第4～6周再按2mg/kg剂量进行腹腔注射，正常对照组大鼠注射等容积的生理盐水，均每周1次，连续6周。以出现心力衰竭病理改变为造模成功。
1.4 分组及给药 大鼠在用基础饲料适应性喂养1周后，随机分为正常对照组、模型组、卡托普利组、安心颗粒低剂量组、安心颗粒高剂量组，每组10只，分笼饲养。造模同时，卡托普利组以6.25mg/kg剂量灌胃，安心颗粒低、高剂量组分别按0.8g/kg和1.6g/kg剂量灌胃，用药剂量按动物体表面积换算。正常对照组予等容积蒸馏水灌胃。每日1次，自由饮食。
1.5 细胞因子及心肌细胞凋亡检测 末次给药24h，取大鼠主动脉血5mL，分离血清，然后用颈椎脱臼法处死大鼠，剖胸取出心脏，洗净后切取部分左心室组织，用40g/L多聚甲醛液固定12h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片进行形态学观察。血清细胞因子TNF?α、IL?6检测：采用双抗体夹心酶联免疫吸附（ELISA）法，严格按试剂盒说明操作。心肌细胞凋亡检测：采用TUNEL法，按试剂盒说明操作，以细胞核被染成棕褐色为阳性结果。每个标本观察5张切片，每张切片随机选取5个高倍视野（×400）中的凋亡阳性细胞，平均阳性细胞百分数。按公式计算凋亡指数：Ｉ凋亡=n凋亡细胞核/n总细胞核。
1.6 统计学方法 采用SPSS 12.0统计软件进行统计分析。
2 结果
2.1 各组大鼠心肌病理形态学观察 光镜下观察心肌组织切片，正常对照组大鼠可见心肌形态正常，胞浆纹理清晰。其他各组可见程度不同的肥大心肌细胞群，细胞排列紊乱，断裂、溶解、炎性细胞浸润，卡托普利组及安心颗粒低、高剂量组较模型组改变较轻。模型组还可见肺泡壁破裂、融合、水肿、淤血改变，且肝组织苏木素-伊红（HE）染色可见肝窦扩张淤血，提示心衰模型制备成功。结果见图1。
2.2 各组大鼠血清TNF?α、IL?6及心肌细胞凋亡指数比较 在造模过程中，模型组有3只，卡托普利组及安心颗粒低、高剂量组各有2只大鼠死于心力衰竭，正常对照组有1只因灌胃不当死亡。表1结果显示：模型组血清ＴＮＦ?α、ＩＬ?６水平及Ｉ凋亡均显著性升高（Ｐ＜０.０５），安心颗粒低、高剂量组均可显著性降低模型大鼠的血清ＴＮＦ?α、ＩＬ?６水平及Ｉ凋亡（Ｐ＜０.０５或Ｐ＜０.０１），且呈一定的剂量效应关系。
2.3 各组大鼠心肌细胞凋亡图片比较 模型组可见棕褐色细胞核明显增多，正常对照组偶见，卡托普利组及安心颗粒低、高剂量组均较少，结果见图2。
a1.正常对照组心肌b1.模型组心肌c.卡托普利组心肌d.安心颗粒低剂量组心肌e.安心颗粒高剂量组心肌
a2.正常对照组肺b2.模型组肺a3.正常对照组肝b3.模型组肝
图1 各组大鼠心肌、肺、肝组织病理形态学改变（×200）（略）
Figure 1 Changes of pathologic feature in heart，lung and liver tissues of different groups
表1 各组血清TNF?α、IL?6及心肌细胞I凋亡比较（略）
Table 1 Comparison of serum TNF?α,IL?6 and cardiomyocyte AI in different groups
统计方法：单因素方差分析；①Ｐ＜０.０５，与正常对照组比较；②Ｐ＜０.０５，③Ｐ＜０.０１，与模型组比较；④Ｐ＜０.０１，与安心颗粒低剂量组比较
a.正常对照组b.模型组c.卡托普利组d.安心颗粒低剂量组e.安心颗粒高剂量组
图2 各组大鼠细胞凋亡检测比较（TUNEL法，×400）（略）
Figure 2 Cardiomyocyte apoptosis detection in different groups
3 讨论
炎性细胞因子是慢性心力衰竭（CHF）病理生理和发病机制中的重要因子，它包括肿瘤坏死因子?α（TNF?α）、白介素?1β（IL?1β）、白介素?6（IL?6）等，其中TNF?α和IL?6与CHF密切相关［4］。有研究表明，TNF?α通过负性肌力作用、诱导心室重塑、促发心肌细胞凋亡、介导CHF恶病质的发生等多种途径参与了CHF的发生和［5］。与TNF?α相类似，IL?6参与CHF 的途径也是抑制心肌收缩力、诱导心室重塑及促发心肌细胞凋亡等［6］。TNF?α、IL?6水平增高可诱导心肌凋亡的发生，导致心肌细胞数量减少，心肌收缩单元不断丧失和心肌顺应的下降，最终出现进行性心肌重构，使心功能进行性下降恶化［7］。临床研究也发现CHF患者血清TNF?α和IL?6水平显著升高，TNF?α、IL?6水平随心功能级别增高而升高，并与左心室射血分数（LVEF）成显著负相关［8］。
本实验研究表明，CHF模型大鼠血清TNF?α、IL?6含量和心肌细胞Ｉ凋亡较正常组显著升高（Ｐ＜０.０5），且心肌凋亡细胞明显增多，提示CHF的发生与细胞因子诱导及心肌细胞凋亡有着密切的关系，与报道相一致［7］。在给予安心颗粒和卡托普利干预后，可显著降低血清TNF?α、IL?6含量和心肌细胞Ｉ凋亡，减少心肌凋亡细胞数量，尤其是高剂量安心颗粒，其作用与西药卡托普利相仿。卡托普利是一种血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）。临床研究证实，该类药能改善心肌重塑，改善心衰患者临床症状和心功能，提高生存率。其主要机制是干扰肾素-血管紧张素醛固酮系统，抑制血管紧张素Ⅱ及抑制缓激肽的降解，增加缓激肽的活性及其介导前列腺素的生成，是目前公认心衰的一线药物［9］。
心力衰竭属于中医"心悸"、"水肿"等病证范畴，多因心（阳）气受损，气血津液运行不畅，以致瘀血、痰饮、水湿停聚，进而阳气虚衰所致，属于沉痼之疾。治宜益气通阳、逐瘀通脉、化痰利水。安心颗粒（原名益心脉颗粒）是我院附属瑞康临床多年用于治疗冠心病的复方中药制剂。该药由人参、桂枝、瓜蒌、水蛭、茯苓等中药制成，方中人参大补元气，为主药；桂枝通阳行脉，为辅药；瓜蒌、水蛭化痰逐瘀，为佐药；并以茯苓利水消痰，为使药。药理研究证实［10］，人参有兴奋心脏作用，可增加心肌收缩力；桂枝挥发油有强心、利尿作用；瓜蒌能扩张冠状动脉，对急性心肌缺血有显著保护作用；水蛭能防止血栓形成，改善局部血液循环；茯苓有明显利尿作用。诸药配伍，具有强心利尿、标本同治之功。近年来临床用于慢性心力衰竭的治疗也取得了显著效果［11］。至于其作用机制，可能与该药能降低炎性细胞因子TNF?α和IL?6含量，并通过抑制TNF?α和IL?6引起心肌细胞凋亡的作用，延缓心肌重塑，改善心脏功能，从而阻止CHF的发展有关。其确切机制有待进一步研究。
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