二至丸加味方对D?半乳糖所致衰老模型大鼠体内自由基和免疫功能的影响
作者：池凤好， 陈媛媛， 范瑞强
【摘要】 【目的】观察二至丸加味方对衰老模型大鼠体内自由基和免疫功能的影响。【方法】选用2.5月龄SD大鼠60只，随机分为5组：正常对照组，模型组，二至丸加味方高、中、低剂量组（剂量分别为11.5、7.0、3.5g·kg-1·d-1）；除正常对照组以外，其他组均采用D?半乳糖300mg·kg-1·d-1腹腔注射2个月复制亚急性衰老模型，二至丸加味方各组分别按设计剂量连续灌胃给药2个月。检测各组大鼠全血超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、血清白细胞介素?2（IL?2）水平和脾脏指数。【结果】模型大鼠全血SOD、血清IL?2水平以及脾脏指数均显著性降低，而血清MDA水平显著性升高（均Ｐ＜０.０５）；二至丸加味方高、中、低剂量组均可不同程度地升高SOD、IL?2水平及脾脏指数，降低MDA水平（P＜0.05或P＜0.01）。【结论】二至丸加味方抗衰老的作用可能与其能清除自由基、提高机体免疫功能有关。
【关键词】 二至丸加味方／药 衰老／中药疗法 衰老/免疫学 自由基／血液 疾病模型 动物 大鼠
机体衰老的一个明显的表现就是皮肤的衰老，其不仅有损美容，而且与许多皮肤病的发生有着病因学的联系，如何预防和延缓皮肤衰老成为生命研究的热点。二至丸加味方具有滋补肝肾、补中益气、活血养颜等功效，临床观察具有抗皮肤衰老作用［1］。本研究观察了二至丸加味方对D?半乳糖所致衰老模型大鼠体内自由基和免疫功能的影响，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 动物与分组 选用2.5月龄SD雄性大鼠（SPF级）60只，体质量280～300g，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：SCXX（粤）2003?0002。饲养环境安静，室温（20±1）℃，照明，以标准实验大鼠全价颗粒饲料、符合清洁实验室要求的净化自来水喂养。所有大鼠随机分为5组，每组12只，即正常对照组，模型组，二至丸加味方高、中、低剂量组。
1.2 药物 二至丸加味方（女贞子、旱莲草、黄芪、丹参等）药物由广东省中番禺制剂室制备，将其浓缩成5.3g/mL（以生药计），高压灭菌，4℃冰箱保存备用，实验中用灭菌蒸馏水配成1kg/L的溶液；D?半乳糖购于广州威佳科技有限公司（批号：2K06D518），用灭菌蒸馏水配成100g/L的溶液。
1.3 试剂与仪器 超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、蛋白定量试剂盒均购于南京建成生物制品研究所；白细胞介素?2（IL?2）试剂盒购于深圳晶美生物工程有限公司；JJ电动玻璃匀浆器（江苏金坛市佳美仪器厂）；Biofuge 28RS低温高速离心机（德国Heraeus 公司）；CARY100紫外分光光度计（澳大利亚瓦里安公司）；Bio?RAD Mode1 550nm酶标仪（美国）；GRANT SUB14恒温水浴箱（英国Grant公司）。
1.4 造模［2］及给药方法 正常对照组大鼠每天给予生理盐水1mL腹腔注射，其他各组给予100mg/LD?半乳糖300mg·kg-1·d-1腹腔注射，连续2个月。正常对照组、模型组以生理盐水2mL/d灌胃；二至丸加味方高、中、低剂量组分别按11.5、7.0、3.5g·kg-1·d-1剂量灌胃给药，连续2个月。
1.5 观察指标 大鼠用乙醚麻醉，眼眶底静脉取血，用抗凝管接取测定全血SOD、MDA含量，具体操作步骤按试剂盒说明书。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法测定血清IL?2水平。大鼠称体质量，用100g/L的水合氯醛溶液2mL腹腔注射麻醉，取出脾脏，用生理盐水洗净，剥离表面结缔组织等，滤纸吸干水分，天平称质量，脾脏指数：wspleen=mspleen/mbody。
1.6 统计学方法 采用microsoft office excell 2003版软件进行数据的统计分析。
2 结果
各组对大鼠全血SOD、MDA及血清IL?2水平、脾脏指数的影响 表1结果显示，模型组与正常对照组比较，全血中的MDA水平显著性升高，全血SOD、血清IL?2水平以及脾脏指数均显著性降低（均P＜0.05），提示D?半乳糖亚急性大鼠衰老模型复制成功。与模型组比较，二至丸加味方中剂量组可显著性升高SOD活性（P＜0.01）；二至丸加味方低剂量组可显著性提高SOD活性、血清IL?2水平和脾脏指数，降低MDA水平（均P＜0.05）；二至丸加味方高剂量组可显著性升高衰老大鼠的脾脏指数（P＜0.05）。
表1 各组对大鼠全血SOD、MDA及血清IL?2水平、脾脏指数的影响（略）
Table 1 Comparison of whole blood levels of SOD and MDA and serum IL?2 level as well as spleen index in different groups
统计方法：t检验；①P＜0.05，与正常对照组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型组比较
3 讨论
机体的衰老是一个极其复杂的过程，主要与自由基代谢失调、机体免疫力下降有关。自由基学说认为，机体衰老是由于随着年龄增加，体内如SOD、谷胱甘肽（GSH?Px）等抗氧化酶活性降低，清除自由基能力下降，自由基在体内大量堆积，引起脂质过氧化终产物丙二醛（MDA）增多。MDA是活泼的交联剂，可迅速与磷脂酰乙醇胺生成荧光色素，然后与蛋白质、肽类、脂类结合形成板层状脂褐质（LF）沉积在细胞、组织，能使机体内多种生物大分子变性、断裂，引起细胞结构和功能的破坏，而导致机体的衰老［3］。伴随着年龄的增长，机体免疫功能逐步紊乱，淋巴细胞分裂增殖能力下降，其中以T细胞功能低下最为显著［4］，尤其是T细胞产生的IL?2合成减少、活性降低被认为是免疫衰老的主要分子机制［5］。
中医理论认为人的衰老主要与肝肾脾虚及气血瘀阻相关。气血是人体脏腑活动功能和物质的基础，内养五脏六腑，外达皮毛，对全身起着濡养的作用。脾为气血生化之源，肝藏血，肾藏精，精血互化，肝肾同源；肝主疏泄，肝之疏泄正常则气血和调，脏腑功能协调，正气旺盛，故能预防疾病和延缓衰老的发生。《灵枢·天年篇》："人生十岁气血已通……，四十岁血气懈惰"。《素问病机气宜保命集》："五十至七十岁血气凝泣"。可见衰老的与气虚血瘀是相互平行的，延缓衰老，于滋养肝肾同时要益气活血。二至丸加味方中女贞子、旱莲草具有滋补肝肾的作用，配伍黄芪、丹参等补中益气、活血化瘀的药物，共奏滋补肝肾、益气活血之功效。本观察结果表明，与正常对照组比较，模型组SOD活性显著降低，MDA活性显著上升，血清IL?2水平与脾脏指数显著下降，再次证实了随着年龄的增长，机体清除自由基能力和免疫功能会随之下降。二至丸加味方组均可不同程度升高体内SOD活性，降低MDA水平，升高血清IL?2水平和脾脏指数，说明二至丸加味方口服具有抗氧化、清除体内自由基、提高人体免疫力和延缓衰老等作用。
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［１］陈勤．抗衰老研究方法学［M］．北京：医药科技出版社，１９９7：85．
［２］杜冠华，裘月，田月娥，等．丹酚酸A对大鼠半乳糖性白内障形成的抑制作用［Ｊ］．药学学报，1995，30（8）：561．
［３］陈瑾，李荣亨．衰老的自由基机制［J］．中国老年学杂志，2004，24（7）：677．
［４］Robinowich H，Goses Y,Reshelf T.Interleukin?2 production and activity in aged humans［Ｊ］．Mech Aging Dev,1985,32：213．
［5］Provinciali M,Argentati K,Tibaldi A.Efficacy of cancer gene therapy in aging:adenocarcinoma cells engineered to release IL?2 are rejected but do not induce tumor specific immune memory in old mice［Ｊ］．Gene Therapy,2000,7(7)：624．
