平肝潜阳法对高血压模型大鼠下丘脑蛋白质表达的影响
【摘要】 【目的】 观察平肝潜阳法对高血压肝阳上亢证模型大鼠下丘脑蛋白质表达差异的影响，从蛋白质组学水平探讨其降血压和改善肝阳上亢证症状的分子机制。【方法】选用自发性高血压大鼠（SHR）灌服附子汤法复制高血压肝阳上亢证大鼠模型，以ＳＤ大鼠作正常对照，组给予天麻钩藤饮加减方灌胃给药（0.1g/mL）；采用二维凝胶电泳（2?DE）分离大鼠下丘脑蛋白质，获得差异表达蛋白质；利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI?TOF?MS）和数据库分析鉴定差异表达蛋白质。【结果】 高血压肝阳上亢证大鼠模型复制成功，其易激惹程度、饮水量、收缩压等与正常组比较，差异均有显著性意义（Ｐ＜０.０１）；治疗组给予中药天麻钩藤饮加减方治疗后，易激惹程度好转，饮水量减少，收缩压下降，与模型组比较差异均有显著性意义（Ｐ＜０.０１）。肝阳上亢模型组蛋白质图谱中有5个蛋白质斑点，与正常组比较表达上升2倍及以上，且同一点在平肝潜阳法治疗组中表达下降2倍及以上；有10个蛋白质斑点表达下降2倍及以上，且同一点在平肝潜阳法治疗组中表达上升2倍及以上。【结论】 平肝潜阳法治疗高血压肝阳上亢证的作用可能与下丘脑某些蛋白质的改变有关。
【关键词】 高血压／中药疗法 平肝潜阳法 蛋白质组学 疾病模型 动物 大鼠
原发性高血压病（essential hypertension，EH）是一种常见的心血管系统疾病，具有发病率高、并发症多的特点。流行病学研究提示人群高血压病患病率较10年前明显增高［1］。长期高血压病极易导致心、脑、肾等脏器的器质性病变和功能损害，并最终导致这些器官的功能衰竭。肝阳上亢证是高血压病中的常见证型，据统计在高血压病中约占 87.33%［2］。平肝潜阳法是治疗高血压病肝阳上亢证的传统治法，不仅能有效降低患者的血压水平，还可改善患者的生存质量，降低并发症的发生，已有研究从分子、基因等水平探讨其作用机制，取得了有意义的进展［3］。为了进一步从蛋白质水平探讨其作用机制，我们应用差异蛋白质组技术，观察了平肝潜阳法治疗高血压肝阳上亢证大鼠前后下丘脑蛋白质表达谱的变化，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 动物 正常健康Sprague Dawley（SD）雄性大鼠10只，清洁级，8周龄，体质量（200±10）g，由中南大学湘雅医学院实验动物部提供（医动字第20?010 号）；自发性高血压大鼠（SHR）20只，雄性，清洁级，8周龄，体质量（200±10）g，由上海斯莱克公司提供〔许可证号：SCXK（沪）2003?0003〕。
1.2 药物制备 附子汤由 60g 单味制附子（由中南大学湘雅中药房提供）组成，先将药物浸泡 30 min，煎煮２次后再将药液合并浓缩为含生药 0.1 g/mL。天麻钩藤饮加减方：天麻 10g，钩藤 20 g，石决明 30 g，牡蛎 30 g，牛膝 10 g，均由中南大学湘雅医院中药房提供。石决明先煎 20 min，钩藤后下，煎煮２次后再将药液合并浓缩为含生药0.1 g/mL。
1.3 主要试剂与仪器 2?DQuantKit蛋白质定量试剂盒、固相pH梯度干胶条（IPGstrip pH3?10L，24cm）、IPG Buffer （PH3?10L）、覆盖液均由Amershan Biosciences公司提供；二硫苏糖醇（DTT）、丙烯酰胺、甘氨酸、苯甲基磺酸氟（PMSF）、3?［（3?胆酰胺丙基）?二乙胺］?丙磺酸（CHAPS）、十二烷基硫酸钠（SDS）、N?N?N′?N′?四甲基乙二胺（TEMED）、考马斯亮蓝、琼脂糖均由Sigma公司提供；低分子量标准蛋白质由上海伯奥生物制品公司提供；Tris?base为USB公司分装；碘乙酰胺购自Fluka公司。Ettan IPG?phorⅡ等电聚焦仪、Ettan DALTⅡSystem垂直电泳槽（Amersham公司）；PDQuest 7.0分析软件（Bio?Rad公司）；Imagescanner扫描仪（Sigma公司）；Elx800自动酶标仪（Bil?Tek Instru?ments，Inc）；真空冷冻抽干仪（Ｓavant公司）；4307MALDI?TOF?MS质谱仪（ABI公司）；二道生理记录仪（成都仪器厂）；清醒小动物血压测量器（中南大学湘雅医学院心脏生理研究室）。
1.4 分组与造模 正常组SD大鼠10只；治疗组及模型组ＳＨＲ大鼠各１０只，完全随机（随机排列表法）分组。正常组大鼠连续灌服蒸馏水 42d，于第 43天处死。治疗组及模型组参照鄢东红等［4］的方法，连续灌服附子汤共 21d，复制高血压肝阳上亢证模型；自第 22 天起模型组改为连续灌服蒸馏水 21d，治疗组在同一时间灌服天麻钩藤饮加减方，均于第 43天处死。模型复制成功的标准参照鄢东红等［4］的方法，观察大鼠的外观及易激惹程度、饮水量、血压的变化（造模前，第3周末，第6周末）。血压测定采用杨绿化等［5］的尾动脉搏动法。各组动物腹腔注射水合氯醛麻醉，快速断头处死，冰上剥离下丘脑，装在标记好的冻存管后放在液氮中保存备用。
1.5 二维凝胶电泳（2?DE）分离和分析
1.5.1 蛋白质双向电泳分离 采用2?DQuantKit蛋白质定量试剂盒的微量测试法测定总蛋白质浓度，蛋白质定量采用Bradford法［6］。蛋白质双向电泳IPGhorTM等电聚焦系统操作指南进行。参照［7］进行考马斯亮蓝染色。
1.5.2 凝胶图像分析 采用Image Scanner扫描仪及LabScan扫描软件进行扫描，获取图像。以PDQuest 7.0分析软件进行图像分析。参照文献［8］，将蛋白质表达水平上升或下降200%的点选择为目标点进行鉴定。
1.6 差异蛋白质点的质谱分析和数据库检测
1.6.1 蛋白质的胶内酶解 切取差异表达蛋白质斑点，经水洗、脱色处理后，参照Fernandez J等［9］的方法并加以改进进行蛋白质的胶内酶解和萃取，获得蛋白质肽混合样品。
1.6.2 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 （MALDI?TOF?MS）检测 肽段样品采用MALDI?TOF?MS检测，获得的混合物肽片段质量指纹图谱在Swiss?prot数据库搜索进行蛋白鉴定。
1.7 统计学处理 使用SPSS 13.0软件包进行统计学分析。
2 结果
2.1 大鼠外观及易激惹程度变化 模型组、治疗组大鼠在附子汤灌胃3周后，其易激惹程度发生了变化，多表现为Ⅲ级，且大部分出现了眼结合膜充血，与正常组比较，差异有显著性意义（Ｐ＜０.０１）；治疗组经中药天麻钩藤饮加减方治疗后（第6周末），其易激惹程度及眼结合膜充血均较前好转，易激惹程度多表现为Ⅰ、Ⅱ级，眼结合膜充血大鼠数亦较前减少，与治疗前比较差异均有显著性意义（Ｐ＜０.０１）。结果见表1。
2.2 大鼠饮水量变化 模型组、治疗组在附子汤灌胃3周后，饮水量均较造模前增加，与正常组及造模前比较差异有显著性意义（Ｐ＜０.０１）；治疗组经天麻钩藤饮加减方治疗后，饮水量较治疗前及模型组显著减少（Ｐ＜０.０１），与正常组接近（Ｐ＞０.０５）。结果见表2。
2.3 大鼠血压动态变化 模型组、治疗组在附子汤灌胃3周后，其收缩压均较造模前提高，与造模前及正常组比较差异有显著性意义（Ｐ＜０.０１）；治疗组经中药天麻钩藤饮加减方治疗后，收缩压均较治疗前下降，与模型组及治疗前比较，差异均有显著性意义（Ｐ＜０.０１）；但与造模前比较，差异无显著性意义（Ｐ＞０.０５）。结果见表3。
2.4 各组大鼠下丘脑蛋白质双向电泳（2?DE）图谱 电泳图谱经考马斯亮蓝染色，Image Scanner扫描后，用PDQuest 7.0分析软件可以检测到每组总蛋白质分布模式非常相似，且重复性好，每组约有700个左右的蛋白质斑点，以PI 4?8和Mr 2 000?75 000范围的蛋白质斑点分布最多。结果见图1。
2.5 各组差异表达蛋白 与正常组比较，模型组图谱中有5个蛋白质斑点表达上升2倍及以上，且同一点在治疗组中表达下降2倍及以上，大致处于与正常组同一水平，有的点甚至较正常组低2倍或以上；有10个蛋白质斑点表达下降2倍及以上，且同一点在治疗组中表达上升2倍及以上，大致处于与正常组同一水平，有的点甚至较正常组高2倍或以上。结果见图2。
2.6 质谱结果 对13个差异显示蛋白质斑点进行胶内酶切，MALDI?TOF?MS测定肽质量指纹谱，在网站上利用MASCOT软件检索Swissprot蛋白质数据库进行鉴定，共鉴定出 8 个蛋白，另外5个蛋白斑点由于没有得到令人满意的肽质指纹图谱或搜索数据库时不能得到可信度较高的结果而未能鉴定。其中细胞质苹果酸脱氢酶、转导蛋白α亚单位同系蛋白、甘油醛?3?磷酸脱氢酶在模型组表达较正常组上调，而治疗组重新下调至治疗前水平；线粒体异柠檬酸脱氢酶α亚单位前体、谷氨酰胺合成酶、蛋白酶体α亚单位、磷酸甘油酸变位酶1、果糖二磷酸醛缩酶C在模型组表达较正常组下调，而治疗组重新上调至治疗前水平。
鉴定蛋白相关信息见表4。
表1 各组大鼠外观及易激惹程度变化比较（略）
Table 1 Comparison of macroscope features and irritation degree in different groups
统计方法：t检验；①Ｐ＜０.０５，②Ｐ＜０.０１，与正常组比较；③Ｐ＜０.０１，与模型组比较；④Ｐ＜０.０１，与同组第3周末比较
表2 各组大鼠饮水量变化比较（略）
Table 2 Comparison of in?take water volume in different groups
统计方法：t检验；①Ｐ＜０.０１，与正常组比较；②Ｐ＜０.０１，与模型组比较；③Ｐ＜０.０１，与造模前比较；④Ｐ＜０.０１，与同组第3周末比较
表3 各组大鼠血压动态变化比较（略）
Table 3 Comparison of dynamic changes of blood pressure in different groups
统计方法：t检验；①Ｐ＜０.０１，与正常组比较；②Ｐ＜０.０１，与模型组比较；③Ｐ＜０.０１，与造模前比较；④Ｐ＜０.０１，与同组第3周末比较
表4 治疗后差异表达蛋白（略）
Table 4 The differential expressed proteins after treatment
a.正常组 b.模型组 c.治疗组
图1 各组大鼠下丘脑蛋白质2?DE图谱（略）
Figure 1 Hypothalamic protein expression in different groups
a.正常组 b.模型组 c.治疗组
图2 差异表达蛋白局部显示图（略）
Figure 2 Features of differential expressed proteins
3 讨论
高血压肝阳上亢证型是高血压病所有证型中最多见的证型，本证近10余年的临床研究发现其病理生基础为外周交感-肾上腺髓质功能亢进,主要病理环节为外周血浆去甲肾上腺素（ＮＥ）、肾上腺素（Ｅ）含量的增高［10］，下丘脑存在血压神经内分泌调节活动，它的一些功能的改变与高血压病有关。Kubo等［11］发现SHR大鼠下丘脑前区血管紧张素敏感性神经元活性明显高于WKY大鼠。Fisher等［12］发现外源性胰岛素在SHR下丘脑前区产生血压下降，可能通过其受体对脑内血管紧张素系统调节进而影响外周交感神经系统产生血压下降。张露青等［13］发现SD大鼠视上核含有的加压素较SHR自发性高血压病大鼠少，提示视上核加压素含量的异常增加可能与高血压病的发病有关［13］。
《素问·玄机原病式·五运主病》云:"风火皆属阳，多为兼化，阳主升动，两动相搏则为之旋转。" 肝阳上亢证主要是由于肝肾阴虚，阴不制阳而致肝阳偏亢，因而着眼于平肝潜阳。天麻钩藤饮加减方中，天麻、石决明平肝潜阳，是治肝阳眩晕之要药，为君药；钩藤清肝热、平肝熄风，使肝经之热不致偏亢，加强君药之功效，为臣药；牡蛎咸寒质重，重镇安神；川牛膝引头部血液下行，减轻脑充血。
本研究中发现模型组、治疗组大鼠在附子汤灌胃后，提尾时尖叫、惊跳，甚至咬人或同笼大鼠频繁打斗，大部分眼结合膜充血，与正常组比较差异显著。治疗组在中药治疗后，其易激惹程度及眼结合膜充血均较前好转。本实验成功复制高血压肝阳上亢证大鼠模型，通过平肝潜阳治法，有效降低了血压，改善了症状。
蛋白质是生物细胞赖以生存的各种代谢和调控途径的主要执行者，是多种致病因子对机体作用最重要的靶分子，以及大多数疾病干预措施的靶标［14］。差异蛋白质组学是蛋白质组学的重要内容之一，旨在依据样本在不同时期、不同组织、不同状态或不同外界条件作用下所表达的蛋白质的不同来达到鉴定、筛选蛋白质的目的，绘制差异蛋白质谱，寻找差异位点。通过对差异蛋白质的分析鉴定可以研究编码该差异蛋白的基因，扩展对该基因功能的了解，也可以结合功能蛋白质组学研究，甚至发现新的蛋白质，具有很强的可实现性。
本实验应用差异蛋白质组技术，观察平肝潜阳法治疗高血压肝阳上亢证大鼠后，其下丘脑蛋白质表达谱的变化，共鉴定出 8 个蛋白，鉴定蛋白的序列覆盖率为22%～61%，和报道的基本一致［15］。
异柠檬酸脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶C、磷酸甘油酸变位酶1、甘油醛?3?磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶等酶是参与糖酵解和三羧酸循环中的关键酶，在本实验中出现表达改变。异柠檬酸脱氢酶存在于线粒体上，其功能是催化异柠檬酸氧化为α?酮戊二酸而参与三羧酸循环，是调节三羧酸循环最主要的酶；果糖二磷酸醛缩酶C通过加快细胞内糖或带有糖支链物质的代谢，增加细胞解毒功能，进而增加体系耐药性，并为细胞提供更多的能量来抵抗外界压力［16］；甘油醛?3?磷酸脱氢酶除参与糖酵解外,尚具有尿嘧啶DNA糖苷水解酶、转录启动子、微管排列及诱导细胞凋亡的功能，胞核中该酶可同DNA紧密结合,诱导细胞凋亡，此酶在模型组下丘脑中表达上调，提示其神经元凋亡率升高。这些与能量代谢有关的酶的差异表达表明高血压肝阳上亢证发生后能量代谢发生障碍。机体能量利用障碍，细胞热生成减少，物质代谢速度减慢易引起糖、脂肪等供能物质的储积，而脂肪的储积、脂类代谢的紊乱，又可导致细胞膜脂质成分的改变，对膜上各种酶活性产生影响，进一步加重物质代谢的障碍。高血压病肝阳上亢证患者代谢紊乱的发生与此不无关系。
蛋白酶体亚单位是与蛋白质降解通路有关的蛋白质。Chondrogianni 等［17］发现，蛋白酶体β5亚单位过表达可以增加蛋白酶体的组装，改善氧化应激反应。已知高血压病的发生存在胰岛素抵抗，Morisco 等［18］发现蛋白酶体介导的降解作用在胰岛素抵抗中对胰岛素受激酪氨酸磷酸化及胰岛素抵抗底物蛋白的抑制发挥重要的作用。免疫蛋白酶体亚单位LMP7在肾血管性高血压实验模型局部缺血的肾中发生了变化［19］。本研究发现蛋白酶体α亚单位在模型组表达较正常组下调，在治疗组重新上调至治疗前水平，推测其治疗前后氧化应激水平发生了改变，平肝潜阳法治则与改善氧化应激及胰岛素抵抗有关。
正常情况下神经元通过谷氨酸-谷氨酰胺循环维持正常的生理活动，当此循环被破坏时，就会造成谷氨酸代谢的紊乱，使脑内兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸失衡。谷氨酰胺合成酶是谷氨酸-谷氨酰胺循环中的限速酶，催化谷氨酸合成谷氨酰胺。有研究显示［20］，使用谷氨酰胺合成酶竞争性抑制剂甲硫氨酸砜亚胺能引起星形胶质细胞内谷氨酸积聚和谷氨酰胺的减少，引发兴奋性毒性作用；谷氨酰胺合成酶表达增高能增加星形胶质细胞谷氨酸摄取率，有神经元保护作用。本研究发现谷氨酰胺合成酶在模型组表达较正常组下调，在治疗组重新上调至治疗前水平，推测高血压肝阳上亢证大鼠谷氨酰胺合成酶含量减少，正常神经兴奋性受到影响，经平肝潜阳法治疗后恢复至正常水平。
有研究发现转导蛋白介导一些神经内分泌信号，在传递神经冲动、调节腺体分泌和细胞分化上发挥功能。Li等［21］发现缺氧诱导的转录因子在含氧量低诱导的肺动脉高（血）压发病机制中发挥重大作用。但在高血压病的研究，特别是高血压肝阳上亢证的研究中暂时还未见报导，其作用机制有待进一步研究。
本文在蛋白质水平上进行动物实验研究，由于在一个电泳条带中含有不止一种蛋白质，所鉴定出来的蛋白质虽然存在于强度发生了改变的条带中，但并不能肯定这些蛋白的强度也发生了相应的改变，因此真正肯定的结果还需要后续的免疫学及mRNA水平的验证。进一步优化反应条件，深入研究分析这些蛋白质，对差异结果进行再验证和下游功能分析至关重要，将有助于进一步了解发生机制，寻找更好的预测指标和干预靶点。
【文献】
［1］刘忠仁.我国各地高血压流行病学调查近况［J］.医学综述，2004，10（2）：88.
［2］陈明嘉.高血压病（肝阳上亢证）的中医治疗及研究近况［J］.中医药导报，2006，12（1）：80.
［3］王佑华，杨建梅，周端.中医药治疗高血压病分子遗传机制研究进展［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2005，3（5）：436.
［4］鄢东红，金益强，肖纯，等.自发性高血压大鼠肝阳上亢证模型的复制［J］.湖南中医学院学报，1999,19（4）:35.
［5］杨绿化，邹沙舟，李云霞.无创测量大鼠收缩压和舒张压的新仪器和新方法［J］.应用生理学杂志，1991,7（1）:62.
［6］Bollag D M，Edelstein S S.Protein methods ［M］.2nd.NewYork：Wiley Liss，1999:141.
［7］Kurt K，Michael F，Gert L.A rat brain protein expression map including cytosolic and enriched mitochondrial and microsomal fractions［J］.Electrophoresis，2003，24:1847.
［8］Linda Paulson，Peter Martin，Anders Persson，et al.Comparative genome and proteome analysis of cerebral cortex from MK?801 treated rats［J］.Neurosci Res，2003，71：526.
［9］Fernandez J，Gharahdaghi F，Mische S M.Routine identification of proteins from sodium dodecyl sulfate?polyacrylamide gel electrophoresis（SDS?PAGE）gels or polyvinyl difluoride membranes using matrix assisted laser desorption/ionization times of flight?mass spectrometry （MALDI?TOF?MS）［J］.Electrophoresis，1998，19：1036.
［10］杨兴才.高血压病肝阳上亢证型的客观化研究［J］.北京中医药杂志，2005，24（1）:58.
［11］Kubo T，Hagiwara Y.Protein kinase C activation?induced increases of neural activity are enhanced in hypothalamus of spontaneously hypertensive rats［J］.Brain Res，2005，1033（2）：157.
［12］Fisher S J，Bruning J C，Lannon S，et al.Insulin signaling in the central nervous system is critical for the normal sympathoadrenal response to hypoglycemia ［J］.Diabetes，2005，54（5）:1447.
［13］张露青，左国平，丁炯.加压素在自发性高血压病大鼠与正常大鼠下丘脑视上核、室旁核神经元内表达［J］.解剖进展，2005，11（3）：213.
［14］Pandey A，Mann M.Proteomics to study genes and genomes［J］.Nature，2000，405：837.
［15］Willy V B，Catherine D，Carla P，et al.Matrix?assisted laser desorption/ionization?tandem mass spectrometry with high resolution and sensitivity for identification and characterization of proteins［J］.Proteomics，2002，2：868.
［16］李航，黎乐群，万里凯，等.1?6?二磷酸果糖醛缩酶对无水酒精注射治疗原发性肝癌的观察［J］.中国肿瘤临床，2004，31（6）：309.
［17］Chondrogianni N，Tzavelas C，Pemberton A J，et al.Overexpression of proteasome beta 5 assembled subunit increases the amount of proteasome and confers ameliorated response to oxidative stress and higher survival rates［J］.J Biol Chem，2005，280（12）：11840.
［18］Morisco C,Lembo G，Trimarco B.Insulin resistance and cardiovascular risk：New insights from molecular and cellular biology［J］.Trends Cardiovasc Med，2006，16（6）：183.
［19］Kruszewski K，Kalinowska J，Chabielska E,et al.Changes in proteasome activity in the ischemic kidney of rat with experimental renovascular hypertension［J］.Rocz Akad Med Bialymst，2004，49 （l 1）：252.
［20］Ostrowska H，Kruszewski K，Kasacka I.Immuno?proteasome subunit LMP7 is up?regulated in the ischemic kidney in an experimental model of renovascular hypertension［J］.Biochem Cell Biol，2006，38（10）：1778.
［21］Li Q F，Dai A G.Differential expression of three hypoxia?inducible factor?alpha subunits in pulmonary arteries of rat with hypoxia?induced hypertension［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2005，37（10）：66.
