HPLC法测定清咽宁喷雾剂中咖啡酸的含量

【摘要】  目的 建立测定清咽宁喷雾剂中咖啡酸含量的方法。方法 采用高效液相色谱法，用依利特BDS C18色谱柱（200 mm×5.0 mm，5 μm），以甲醇?0.013 mol/L磷酸盐缓冲液（体积比23∶77）为流动相；流速为1.0 mL/min，检测波长为320 nm。结果 在0.042 5～ 0.425 μg范围内，峰面积与进样量线性关系良好（r＝0.999 9），加样平均回收率为99.05%，RSD为2.9%。结论 该法简便、可靠、准确，结果满意。

【关键词】  HPLC;清咽宁喷雾剂；咖啡酸；含量测定

　　Determination of caffeic acid in Qingyanning spray by HPLC

　　Abstract:Objective To establish an HPLC method for determination of caffeic acid in Qingyanning spray. Methods The sample was analyzed on a BDS C18  column (200 mm×5.0 mm,5μm) using methanol?0.013 mol/L phosphate salt solution (23∶77) as the mobile phase. The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength 320 nm.Results The method exhibited good linearity from 0.042 5 to 0.425 μg (r=0.999 9). The average recovery was 99.05% and RSD 2.9%. Conclusion The method is convenient, reliable and accurate for the quality control of the spray.

　　Key words:HPLC; Qingyanning spray; caffeic acid

　　清咽宁喷雾剂是主要由蒲公英、忍冬藤等组成的纯中药制剂，具有清热解毒、消炎止痛等功效，可用于口腔炎、口腔溃疡、咽喉炎等症，对小儿口腔炎症有特效。咖啡酸作为蒲公英、忍冬藤两药的抗菌抗病毒的有效成分之一［1］，易于测定。因此，本制剂参照《药典》2000年版一部蒲公英的含量测定方法，以HPLC方法测定本品咖啡酸的含量［2］。实验表明此方法简便，结果准确，可为本品质量控制和新药研发提供依据。

　　1仪器与试药
     
　　高效液相色谱仪:岛津LC?10ATvp泵，岛津SPD?10ATvp紫外检测器。
     
　　咖啡酸对照品由中国药品生物制品检定所提供，批号：110885?200302；清咽宁喷雾剂由本校药物研制中心提供，批号：040628、040926、041218；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
   
　　2方法与结果

　　2.1色谱条件与系统适用性试验
   
　　依利特BDS C18（5.0　mm×200　mm，5 μm）；流动相：甲醇?磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠1.56 g，加水使溶解成1  000 mL，再加1%磷酸溶液调节pH值至3.8～4.0）（体积比23∶77），流速：1.0 mL/min；理论板数以咖啡酸峰，不得低于3 000。

　　2.2溶液的制备

　　2.2.1对照品溶液的制备 
     
　　精密称取在110 ℃干燥至恒重的咖啡酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含咖啡酸30 μg的溶液，即得。

　　2.2.2供试品溶液的制备 
     
　　精密量取本品2 mL，加醋酸乙酯振摇提取3次，每次10 mL，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇适量，使溶解，移入50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，滤过，取续滤液，即得。

　　2.3测定波长的确定 
     
　　取对照品（0.030 mg/mL）溶液，在500～200 nm波长范围内进行扫描，结果在320 nm波长处有最大吸收，见图１，故确定检测波长为320 nm。

　　２.４色谱条件的确定 
     
　　在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5 μL，注入液相色谱仪测定。结果咖啡酸在15 min内出峰，而且与前后的峰均有较好的分离，理论板数在3　000以上。见图2，图3。
   
　　图1紫外光谱图　略
   
　　按本品制剂中工艺方法制得去蒲公英和忍冬藤的空白制剂，与供试品溶液色谱和咖啡酸对照品溶液色谱比较，结果阴性样品中未见咖啡酸色谱峰，见图4。

　　图2－图4　略　

　　2.５线性关系考察
      　
　　精密称取在110 ℃干燥至恒重的咖啡酸对照品17.0 mg,置100 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 mL分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。按上述色谱条件分别注入液相色谱仪5 μL，测定峰面积。以进样量（m）为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归分析，得回归方程Ａ=１０ ３６８m-６１ ３４８，r=0.9999。结果表明：咖啡酸在0.0425～0.425 μg范围内峰面积与进样量呈良好的线性关系。

　　2.６精密度试验
     
　　精密吸取上述线性关系考察中第3号对照品溶液，按上述液相色谱条件，进样测定５次，结果峰面积的ＲＳＤ值为1.2℅，表明方法精密度良好。

　　2.７重复性试验　
     
　　取本品(批号040628)5份，按“2.2.2”项方法制备，进样测定，结果咖啡酸平均质量比为0.500 mg/g，其ＲＳＤ值为1.97%，表明方法重复性好。

　　2.８加样回收率试验 
     
　　取本品(批号040628)6份，精密加入咖啡酸对照品溶液(0.3 mg/mL)，按“2.2.2”项方法制备，进样测定，结果见表１。

　　表1咖啡酸回收率试验结果(略)

　　2.９稳定性试验
     
　　取本品（批号040628）,按“2.2.2”项方法制备，分别于0、1、2、4、8、24 h进行测定峰面积，结果ＲＳＤ值为1.3％，表明本品供试品溶液在0～24 h内基本稳定。

　　2.10样品测定
     
　　取本品3批，照“供试品溶液”和“对照品溶液”方法制备，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液5 μL，按上述色谱条件进行测定，按外标法。结果见表２。

　　表2咖啡酸含量测定结果　略

　　3讨 论 

　　3.1咖啡酸作为蒲公英、忍冬藤两药的抗菌抗病毒的有效成分之一，因咖啡酸微溶于水，易溶于热水和冷乙醇［３］，常用5％（质量分数）甲酸的甲醇溶液、乙醚或醋酸乙酯等提取，本文采用醋酸乙酯为溶剂提取３次，能有效地提取本品的咖啡酸。实验表明该法专属性，重现性较好，结果可靠。

　　3.2通过实验研究，本文建立了清咽宁喷雾剂中咖啡酸含量的HPLC测定法。本法提取较为完全，方法简便可行, 咖啡酸与其他杂质峰分离效果良好，从而为该制剂质量标准的制订提供了依据。

【】
  　　［1］ 江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海科技出版社，１９８６：２４５９.

　　［2］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.北京：化学出版社，２００５：２４４.

　　［3］ 柯铬清.中草药有效成分理化与药理特性［M］.长沙：湖南科技出版社，１９７９：２２２.