青藤碱对佐剂性关节炎大鼠炎症免疫功能的影响

                  作者：陈方军 叶丽 胡伟 张荣宜 程远华

【摘要】  【目的】观察青藤碱（SINO）对佐剂性关节炎（AA）大鼠炎症免疫功能的影响。【方法】选用SD大鼠随机分为正常组，模型组，SINO低、中、高剂量组（剂量分别为60、120、240mg/kg），雷公藤多苷（TPT）组（剂量为30mg/kg）；除正常组外，其他组均采用弗氏完全佐剂足跖皮内注射复制AA模型；各组于造模后第12天开始给药，连续12d；观察不同时间段的大鼠足趾肿胀度及关节评分；采用放射免疫法检测滑膜细胞白细胞介素?1β（IL?1β）、肿瘤坏死因子?α（TNF?α）的含量；观察各组大鼠滑膜细胞的超微结构；采用逆转录-聚合酶链反应检测各组滑膜细胞IL?1β mRNA、TNF?αmRNA的表达。【结果】各剂量组SINO均可不同程度降低大鼠足趾肿胀度和关节炎评分，抑制滑膜细胞产生IL?1β、TNF?α，降低滑膜细胞IL?1β mRNA、TNF?αmRNA的表达（P＜0.05或P＜0.01），恢复AA大鼠滑膜细胞的形态。【结论】SINO类风湿性关节炎的作用可能与其能抑制滑膜细胞分泌炎性介质，恢复滑膜细胞形态有关。

【关键词】  青藤碱/药； 关节炎，类风湿/中药疗法； 关节炎，类风湿/免疫学； 滑膜细胞/超微结构；

    疾病模型，动物；  大鼠

    类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性全身性自身免疫性疾病，病理基础为关节滑膜炎，病因不明，临床表现复杂多样，严重危害了人类的身体健康。青藤碱（sinomenine，SINO）是从中药青风藤中提取的生物碱单体，具有抗炎、免疫抑制、镇痛、降压、抗心律失常等药理作用［1-2］。本研究以佐剂性关节炎（AA）大鼠为模型，观察SINO对AA大鼠滑膜细胞超微结构及分泌炎性细胞因子的影响，现报道如下。

    1  材料与方法

    1.1  动物  SD大鼠,普通级,体质量180～200g，雄性，由安徽省医学研究所实验动物中心提供，合格证号：皖医动准01号。

    1.2  药物及试剂  青藤碱（湖南正清制药厂生产，批号：0009101）；新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司提供，批号：031020）；RPMI?1640粉（Sigma 公司提供）；雷公藤多苷片（TPT，上海复旦复华药业有限公司生产，批号：060503）；卡介苗（BCG，卫生部上海生物制品研究所产品，批号：20060101）；RPMI?1640培养液（Gibco 公司产品）；125I?IL?1β放免试剂盒购于北京北方生物研究所，其他试剂为分析纯。IL?1β引物大小377bp，上游：5′?TTGTGGCTGTGGACAAGCTG?3′，下游：5′?GCCGTCTTTCATACACAGGG?3；TNF?α mRNA 引物大小249bp；上游：5′?CTGGGCAGCGTTTATTCT?3，下游：5′?TTGCTTCTTCCCTGTTCC?3；内参照β?actin引物大小147bp，上游：5′?CACCCTGTGCTGCTCACCGAGGCC?3′，下游：5′?CCACACAGATGACTTGCGCTCAGG?3′；以上引物均由上海生工公司合成。

    1.3  仪器  JT12001型天平由上海精天电子仪器厂生产；YLS?TA足趾容积测量仪由山东省医学院设备站生产；水套式CO2培养箱为美国SHELLAB产品；GL20A全自动高速冷冻离心机由湖南仪器仪表总厂离心机厂生产；YJ?1450型医学净化工作台由苏州净化设备公司生产；倒置式显微镜为日本Olympus产品；J?1230型透射电镜为日本电子公司产品；GC?911型α放射免疫计数仪由科学技术大学中佳公司生产。

    1.4  分组、给药及造模  SD 大鼠随机均分为6组：正常组，模型组，SINO 低、中、高剂量组（60、120、240mg/kg）和TPT组（30mg/kg），每组10只。按报道造模［3］，除正常组外，其他各组均以弗氏完全佐剂（卡介苗80℃、1h水浴灭活后与高压灭菌的液体石蜡充分碾磨混匀配成10mg/mL的乳剂）于每鼠左后足趾皮内注射0.1mL致炎。各给药组分别于致炎第12天开始灌胃给药，连续12d，正常组及模型组给予等容积的溶媒。

    1.5  AA大鼠评价  参照文献［3］，采用足趾容积仪排水法测定右踝关节以下的容积（mL），分别于用药前、用药后第4、8、12、16天同法测量非致炎足的容积变化，以致炎前后差值表示其肿胀度（V肿胀）。多发性关节炎评分如下，0分：无肿胀；1分：1个趾关节受累；2分：多趾关节受累；3分：踝关节以下受累；4分：全爪受累。

    1.6  滑膜细胞培养  致炎后第28天大鼠清醒状态下股动脉放血处死。无菌取双侧膝关节滑膜组织，滑膜细胞培养按文献［4-5］方法进行。以RPMI?1640重悬细胞1×109个/L，取500μL细胞悬液和10mg/L脂多糖（LPS）500μL置6孔板中，37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育48h，收集上清液，-20℃储存，按125I放免试剂盒说明书方法进行白细胞介素?1β（IL?1β）、肿瘤坏死因子?α（TNF?α）含量测定。

    1.7  透射电镜检查  收集滑膜细胞以体积分数4%戊二醛Milloning?s缓冲液预固定，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，10g/L锇酸固定2h，梯度乙醇逐级脱水；环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色，透射电镜观察摄像。

    1.8  滑膜组织IL?1β mRNA、TNF?α mRNA的检测  滑膜组织IL?1β、TNF?α总RNA提取采用常规逆转录-聚合酶链反应（RT?PCR）［4］，用凝胶图像分析仪扫描，Lab Image 3.2凝胶图像分析软件求出目的条带灰度与内参照β?actin标准条带的比值（p）。

    1.9  统计学方法  采用SPSS14.0软件进行方差分析。

    2  结果

    2.1  SINO对AA大鼠继发性炎症的影响  表1结果显示，SINO给药24d后开始发挥疗效，各剂量组SINO均可显著抑制AA大鼠的继发性足肿胀（P＜0.01），以SINO高剂量组作用最显著。

    2.2  SINO对AA大鼠多发性关节炎影响  表2结果显示，致炎后第16天，模型组大鼠非致炎足关节开始出现红肿、变形，行走不便。SINO各剂量组均可显著抑制AA大鼠继发性关节病变（P＜0.05或P＜0.01）。表1  SINO对AA大鼠继发性炎症的影响统计方法：方差分析；①P＜0.05，②P＜0.01，与模型组比较表2  SINO对AA大鼠多发性关节炎的影响统计方法：方差分析；①P＜0.01，与正常组比较；②P＜0.01，与模型组比较

    2.3  SINO对滑膜细胞超微结构的影响  滑膜组织中有两型滑膜细胞，A型滑膜细胞起源于巨噬细胞，B型滑膜细胞起源于成纤维细胞。正常滑膜组织以B型细胞为主，其特征是粗面内质网、游离核糖体较多；与正常组大鼠相比，AA大鼠则多见A型滑膜细胞，细胞内囊泡增多，A型细胞含明显的高尔基体和囊泡分散于细胞质内，粗面内质网少，线粒体肿胀、嵴突破坏；B型滑膜细胞数量减少。各给药组大鼠以B型滑膜细胞为主，B型滑膜细胞粗面内质网略有扩张，但数量减少，少数线粒体肿胀，以SINO中、高剂量组和TPT组改善作用更为明显，结果见图1。

    2.4   SINO对IL?1β、TNF?α含量的影响  表3结果显示，模型组IL?1β、TNF?α高表达，而SINO中、高剂量组对AA大鼠滑膜组织IL?1β、TNF?α的生成有显著抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）。

    2.5  SINO对滑膜IL?1β 及TNF?α mRNA表达的影响  表4结果显示，正常组IL?1β  及TNF?α mRNA低表达，模型组高表达（P＜0.05），SINO各剂量组均可不同程度降低IL?1β 及TNF?α mRNA高表达（与模型组比较，P＜0.05或P＜0.01），且呈一定的剂量效应关系。 表3  SINO对滑膜细胞产生IL?1β、TNF?α含量的影响统计方法：方差分析；①P＜0.01，与正常组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型组比较表4  SINO对IL?1β mRNA、TNF?α mRNA表达的影响统计方法：方差分析；①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型组比较

    3   讨论

    在RA的病理过程中，滑膜炎的一个重要特征是不能控制的滑膜细胞增殖，这种基质成纤维样细胞的增殖被认为是"肿瘤样"的，具有较大的破坏性且重复出现，最终侵袭软骨，造成软骨和骨的破坏［5］。滑膜组织和关节腔内的A型滑膜细胞有吞噬异物的作用，占滑膜细胞总数的10%左右； B型滑膜细胞为主要的滑膜细胞，能合成和修饰所有的细胞外基质(ECM)和滑液成分，其分泌的透明质酸在润滑关节、营养肌腱等方面发挥重要作用,具有较强的损伤修复能力［7］。通过对各组滑膜组织超微结构的观察，发现SINO能显著增加B型滑膜细胞的数量，同时降低A型滑膜细胞的数量，提示SINO在调节炎症致滑膜细胞分化异常，促使炎症修复方面起着一定的作用。

    RA中的滑膜细胞、淋巴细胞、巨噬细胞处于高度活化状态，可合成IL?1β与TNF?α等多种炎性细胞因子。释放入关节滑膜液及血液中的细胞因子IL?1β与TNF?α有许多相似的生物学活性，如促进滑膜纤维细胞和软骨细胞生成胶原酶和前列腺素，诱导糖蛋白的分解与骨的吸收，抑制糖蛋白的合成与骨的形成，刺激B型滑膜细胞增生，使滑膜增厚，生成大量基质金属蛋白酶等［6］。从功能上分析，分布于A型滑膜细胞内的高尔基复合体参与分泌活动，线粒体则为细胞代谢提供能量；B型滑膜细胞内的粗面内质网具有分泌蛋白质等功能［8］。本研究通过对不同类型滑膜细胞具有分泌、代谢功能的细胞器进行观察，结果发现AA模型组在致炎后28d时，滑膜细胞的代谢活性及IL?1 、 TNF? α分泌功能均有所亢进；各组A、B型滑膜细胞中高尔基体、线粒体、粗面内质网、囊泡的数量均有所减少，表明SINO可降低亢进的滑膜细胞功能，保护滑膜细胞结构，从而减轻滑膜细胞变性。在本研究中，AA大鼠滑膜细胞释放较高水平的IL?1β、TNF?α，SINO可抑制IL?1β、TNF?α的产生，下调致炎因子IL?1 mRNA、TNF?α mRNA的表达。表明SINO可通过降低AA大鼠滑膜细胞活化而减轻继发性炎症，该抑制滑膜细胞分泌亢进的功能与透射电镜观察到滑膜细胞具分泌功能细胞器形态改变的结果一致。因此，SINO治疗类风湿性关节炎的作用可能与其能抑制滑膜细胞分泌炎性介质，恢复滑膜细胞形态有关。

【】
  ［1］王勇，方勇飞，周新，等. 青藤碱对佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞表达细胞因子的影响［J］. 中华风湿病学杂志, 2003, 7(7):415.

［2］陈光星，刘良，赵诗哲，等. 青藤碱对胶原诱导型关节炎大鼠滑膜细胞增殖及凋亡影响的研究［J］. 中华风湿病学杂志, 2005,9(5):284.

［3］陈晓宇，李俊，解雪峰，等. 野菊花总黄酮诱导佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡［J］. 解剖学报, 2007,38(5):569.

［4］Niki Y，Yamada H，Seki S，et al. Macrophage and neutrophil dominant arthritis in human IL?1alpha transgenic mice［J］. J Clin Invest，2001，107：1127.

［5］王斌,陈敏珠,徐叔云.大鼠滑膜细胞的分离和培养［J］. 药通报，1994，10（1）:73.

［6］李卫东，冉国霞，林志彬，等.来氟米特对佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞IL?1,IL?6和TNF?α产生的动态影响［J］. 中国药理学报，2002，23（8）:752.

［7］De Bari C, DelI?Accio F,Tylzanowski P, et a1.Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane［J］. Arthritis Rheum ，2001， 44(8)：1928.

［8］Levick J R, McDonald J N. Ultrastructure of transport pathways in stressed synovium of the knee in anaesthetized rabbits［J］. J Physiol，1989，419（2）：493.