活血健脑胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞的保护作用
【摘要】 【目的】研究活血健脑胶囊对大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞的保护作用。【方法】选用SD大鼠，随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组（剂量为10.8mg·kg-1·d-1）、活血健脑胶囊组（剂量为1.8g·kg-1·d-1），后3组再分为缺血2h及再灌注6、12、24h组；采用线栓法复制大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，免疫组织化学法检测神经细胞细胞色素C（Cyt C），原位杂交法检测Caspase?3mRNA、Caspase?9mRNA的表达。【结果】活血健脑胶囊组脑缺血/再灌注6 h 细胞色素C阳性弱表达,与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)，脑缺血/再灌注12h、24h 细胞色素C的阳性表达与模型组及假手术组比较无显著性差异(P＞0.05)。模型组脑缺血再灌注24h海马Caspase?3 mRNA、Caspase?9mRNA的表达达高峰(P＜0.01)；活血健脑胶囊组脑缺血/再灌注24hCaspase?3 mRNA、Caspase?9mRNA表达均减弱, 与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)。【结论】活血健脑胶囊对局灶性脑缺血再灌注后神经细胞的保护作用可能与其能影响神经细胞Cyt C的释放，降低脑缺血/再灌注后脑组织Caspase?3、Caspase?9的活性，从而阻断细胞凋亡的发生有关。
【关键词】 活血健脑胶囊/药； 脑缺血/中药疗法； 脑组织/病理学； 细胞凋亡； 疾病模型，动物； 大鼠
1 材料与方法
1.1 动物与药物
SD大鼠78只，体质量300～350g，鼠龄5～6月龄，雌雄各半，由河南省实验动物中心提供（合格证号： 0001475）。活血健脑胶囊由上海复星临西制药有限公司提供（批号：200400306）；尼达尔片（尼莫地平），20mg/片，由天津市中央药业有限公司生产（批号：020602）；9g/L的氯化钠注射液由北京双鹤药业有限公司提供(批号:030312312)。
1.2 试剂与仪器
PM?10AD光学显微镜 （Olympus optical Co.Ltd，JAPAN）； HITACHI 7500型透射显微镜（JAPAN）；LEICARM2145型自动切片机（德国）；phorbol estersil ( at final concentration of 0.20 μmol/L) + ionomycin (at final concentration of 1 mg/L) for another 48 hours. After marked by monoclonal antibody of CD3 and CD71, the expression of CD3+CD71+ lymphocytes was observed by flow cytometry. Results SINO inhibited the lymphocytes proliferation in a concentration?dependant manner, and particularly had an inhibition on Jurkats cells at G0/G1 phase; MTX had an inhibition on S phase. The stimulation of ConA and phorbol estersil+ionomycin obviously increased the expression of CD3+CD71+ lymphocytes (P＜0.01); SINO at the concentrations of 1 and 0.5 mmol/L inhibited the expression of CD3+CD71+ lymphocytes after ConA stimulation, and SINO at the concentration of 1 mmol/L inhibited the expression of CD3+CD71+ lymphocytes after stimulation of phorbol estersil+ ionomycin (P＜0.05). Conclusion SINO can inhibit the activation and proliferation of T lymphocytes, and block the cells at G0/G1 phase. Its mechanism may be related with the down?regulation of transferring receptor of T lymphocytes and with the decrease of intake of iron ion by the cells.
Key words：SINOMENINE/pharmacology; ARTHRITIS,RHEUMATOID/TCD therapy;
TLYMPHOCYTES; CELL CULTUREHPIAS?1000高清晰度彩色病理图文分析系统（同济医科大学千屏影像工程公司）；Cyt C 、Caspase?3mRNA、Caspase?9mRNA原位杂交试剂盒，由武汉博士德生物工程有限公司提供。
1.3 分组与给药
将78只大鼠按随机法分为假手术组6只，模型组、尼莫地平组、活血健脑胶囊组各24只，后3组再分为缺血2h及再灌注后6、12、24 h组，每组6只。于造模前3d，尼莫地平组灌胃给予尼莫地平10.8mg·kg－1·d－1，活血健脑胶囊组灌胃给予活血健脑胶囊混悬液1.8g·kg－1·d－1 ，假手术组、模型组灌胃生理盐水，均每天1次,共3d，各组最后1次给药2h后造模，造模成功后2h拔出栓线进行再灌注，于再灌注后6、12、24h取材。
1.4 造模方法
所有大鼠均按Longa【４】的方法栓塞右侧大脑中动脉,将单股尼龙线的头端0.5cm热膨胀并打磨后，经颈外动脉-颈总动脉-颈内动脉进入大脑中动脉起始部位，造成栓塞，于栓塞2h拔出栓线，形成缺血后再灌注，再灌注时间分别为6、12、24h。
1.5 指标与检测方法
1.5.1 取材及脑组织病理形态观察 在规定的时间点，将实验成功的大鼠断头后，于冰盘上迅速分离全脑，去除嗅球、小脑及脑干，在冰上将大脑从前向后切成5块厚约1.8mm的大脑冠状切片，每组随机抽取1只动物，其第3张脑片用于电镜观察，其他脑片置于体积分数为10％的福尔马林溶液中固定24h以上，常规苏木素-伊红（HE）染色，光镜观察，图像分析系统分析。
1.5.2 各组神经元超微结构观察 灌注固定后海马经0.1mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）浸洗1h, 10g/L锇酸后固定2h,0.1mol/LPBS洗, 体积分数分别为50%、70%、80%、90%、100%的乙醇逐级脱水，E?pon812包埋, 制作超薄切片经铀-铅双染后,电镜观察神经元超微结构及凋亡细胞。
1.5.3 Cyt C的表达 载玻片在Poly?Lysine液中浸5min，捞片后置58℃～60℃烤箱中 45min以使切片紧密粘附，干燥备用；切片常规脱蜡至水；蒸馏水新鲜配置体积分数为3%H2O2室温处理10min，蒸馏水洗涤2min×3次；切片浸入0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）微波修复10min，反复2次，冷却后以0.1mol/LPBS洗涤2次；滴加正常山羊血清封闭液，室温20min；甩去多余液体，不洗；滴加50μL抗Cyt C，4℃冰箱过夜，0.1mol/LPBS洗涤2min×3次；加入浓度为10g/L的胎牛血清-缓冲液（BSA?PBS）稀释的生物学标记100μL（1∶250稀释），37℃下孵育20min，0.1mol/LPBS洗涤2min×3次；滴加1∶250稀释的过氧化物酶标记链霉卵白素（SABC）100μL，37℃下孵育20min，0.1mol/LPBS洗涤5min×4次；生物素过氧化物酶（DAB）显色。取1mL蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片，室温显色20min左右，蒸馏水洗涤；苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。显微镜观察大脑海马区神经元的Cyt C蛋白表达情况。
在20×10倍的光镜视野下，对Cyt C 染色阳性细胞进行统计，显微镜下胞浆或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞。采用彩色病理图文分析系统，测量Cyt C染色阳性细胞的灰度值，以各测量点的灰度值减去相应背景灰度值后的平均值为各区的平均灰度值。每张切片中采集3个具有代表性的高倍视野，视野中细胞总数不少于100个,主要统计半暗带区及海马区的表达情况,对于缺血区的变化仅作形态学观察,未作统计学处理。
1.5.4 Caspase?3 mRNA、Caspase?9 mRNA的表达 以40g/L多聚甲醛固定脑组织，石蜡包埋，常规切片（6μm厚），脱蜡，水化，以体积分数为30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合，室温5～10min以灭活内源性酶；蒸馏水洗3次。暴露mRNA核酸片段:切片上滴加柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（30g/L柠檬酸lmL加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，室温消化15min；42℃预杂交2h，杂交液中含探针2μg /mL，42 ℃ 杂交过夜，加入抗地高辛抗体(1∶800)，37℃孵育1h，DAB显色37℃、30min左右，典型切片加上不含探针的杂交液做阴性对照。Kitazawa等［5］报道的方法Caspase?3表达程度：计数5个高倍视野，将平均阳性细胞数分为5类，(1)0：阳性细胞少于1％，(2)1：阳性细胞介于1％～25％；(3)2：阳性细胞介于25％～50％；(4)3：阳性细胞介于50％～75％；(5)4：阳性细胞大于75％。根据染色程度将阳性信号分为3类：(1)染色强度弱：+；(2)中等染色强度：++；(3)染色强度强：+++。染色强度×阳性细胞百分数为每个标本染色的综合记分。综合记分＜1为表达阴性，否则，则判为阳性。Caspase?9的测定同Caspase?3稍作改动。
1.6 统计学方法
应用SPSS 11.0 For Windows软件包进行统计分析。
2 结果
2.1 病理形态
假手术组脑组织结构正常，无明显水肿；模型组HE染色缺血损伤累及广泛皮层及纹状体外侧，缺血中心区与周围区界限不易区分，神经元坏死、变性，胞浆嗜酸，胞核溶解，细胞周边呈扇形空泡改变，梗塞中心区可见细胞坏死，部分细胞消失，可见微血管、神经元和胶质细胞。尼莫地平组及活血健脑胶囊组脑组织病理改变较轻，可见神经元、星形胶质细胞呈轻度的肿胀，个别神经元呈变性改变（图1）。
电镜下见假手术组神经元细胞体积大，细胞质丰富，可见粗面内质网、微丝、细胞核大，呈圆形或椭圆形，有1～3个；常染色质丰富，异染色质较少，可见线粒体轻微肿胀现象。模型组神经元及神经胶质细胞胞体固缩或肿胀；细胞核内染色质凝集成块或溶解，异染色质边集，核膜连续性破坏或凹陷，核固缩或溶解坏死；许多线粒体肿胀成空泡状，嵴模糊、断裂、消失，线粒体内基质密度降低，整个细胞浆呈空化状态。尼莫地平组可见核轻度不规则，核膜完整，异染色质边集现象少见；异形线粒体较少，多数线粒体嵴清楚、连续。活血健脑胶囊组神经元线粒体、内质网轻度肿胀,线粒体嵴几乎正常，有3～4个初级溶酶体，1个次级溶酶体，细胞核基本正常，可见大而明显的核仁，细胞质丰富，细胞器量较大，粗面内质网及游离的核糖体量较多，可见较多的神经胶质细胞（图2）。
2.2 Cyt C蛋白表达 假手术组仅见Cyt C蛋白弱阳性表达；模型组大鼠脑缺血再灌注2h后Cyt C蛋白开始表达，再灌注6h表达量达高峰，再灌注12h表达量下降，再灌注24h降至最低点。再灌注24h内Cyt C的表达区域主要集中在海马锥体细胞和齿状回区颗粒细胞。活血健脑胶囊组脑缺血/再灌注6hCyt C阳性表达较弱,与模型组比较有显著性差异(P＜0.01) ,尼莫地平组脑缺血/再灌注12、24hCyt C阳性表达与模型组及假手术组比较均无显著性差异(P＞0.05)。尼莫地平组脑缺血/再灌注6、12、24hCyt C阳性表达与模型组比较均无显著性差异(P＞0.05)。结果见表1、图3。
2.3 Caspase?3mRNA、Caspase?9mRNA的表达
假手术组基底节、皮层、海马Caspase?3mRNA、Caspase?9mRNA阳性表达的神经元数较少。 模型组缺血再灌注后不同时间对缺血侧脑组织中Caspase?3mRNA、Caspase?9mRNA的表达无明
a.假手术组b.模型组c.活血健脑胶囊组d.尼莫地平组图1 各组脑组织病理形态比较（HE染色，×200）
Figure 1 Pathological features of brain tissue in different groups (by HE staining, ×200)
a.假手术组b.模型组c.活血健脑胶囊组d.尼莫地平组图2 各组神经元超微结构比较（×20 000）
Figure 2 Comparison of neuron ultrastructure in different groups (×20 000)
显增加； 再灌注2h,缺血侧脑组织中Caspase?3mRNA、Caspase?9mRNA的表达无明显增强,再灌注6h缺血侧海马Caspase?3mRNA、Caspase?9mRNA的表达较假手术组及缺血对侧增强, 再灌注12hCaspase?3mRNA、Caspase?9mRNA的表达进一步增强，于再灌注24ｈ达高峰,与假手术组比较有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。活血健脑胶囊组脑缺血/再灌注24hCaspase?9 mRNA、Caspase?3mRNA表达均减弱, 与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)，与尼莫地平组比较差异无显著性意义(P＞0.05)。结果见表2、表3、图4、图5。
3 讨论
研究认为各种刺激诱导的细胞凋亡，在细胞凋亡之前出现线粒体膜电位低下，引起膜的通透性增加，膜中存在的50kD的蛋白质AIF（apoptosis inducing factor）向细胞质中漏出，激活非活性的Caspase?3使之活化［5］。电子传递体系中的细胞色素C也从线粒体中向细胞质中漏出，在细胞质中存在的脱氧腺苷三鳞酸（dATP）和凋亡酶激活表1 各组大鼠脑缺血/再灌注后海马Cyt C表达比较 统计方法：t检验；①Ｐ＜０.０1，与假手术组比较；②P＜0.01，与模型组比较表2 各组大鼠脑缺血再灌注后大鼠海马Caspase?3mRNA表达比较统计方法：Ridit 检验；①Ｐ＜０.０5，②P＜0.01，与假手术组比较；③P＜0.01,与模型组比较表3 各组大鼠脑缺血再灌注后大鼠海马Caspase?9mRNA表达比较统计方法：Ridit 检验；①Ｐ＜０.０1，与假手术组比较 ；②P＜0.01，与模型组比较
a.假手术组b.模型组c.活血健脑胶囊组d.尼莫地平组图3 各组Cyt C表达比较（免疫组化，×200）
Figure 3 Comparison of Cyt C expression in different groups (by immunohistochemistry,×200)
a.假手术组b.模型组c.活血健脑胶囊组d.尼莫地平组图4 各组Caspase?3 mRNA表达比较（原位杂交，×200）
Figure 4 Comparison of Caspase?3 mRNA expression in different groups (by in?situ hybridization,×200)
a.假手术组b.模型组c.活血健脑胶囊组d.尼莫地平组图5 各组Caspase?9 mRNA表达比较（原位杂交，×200）
Figure 5 Comparison of Caspase?9 mRNA expression in different groups (by in?situ hybridization,×200)
因子?1（Apaf?1）的作用下，激活非活性的Caspase?3使之活化，从而将细胞凋亡的信息传递下去［6］。另外，氧自由基产生、兴奋性氨基酸的毒性作用、细胞内钙超载、炎症介质的释放皆直接或间接引发线粒体结构和功能的改变及细胞色素C的释放，而这些改变又加重了自由基产生、兴奋毒作用及钙超载［7-8］。
本实验脑缺血再灌注24h组海马神经元损伤较重,从细胞质到细胞核均发生了严重变化,甚至坏死。随着缺血再灌注时程的增加，线粒体数目减少且明显肿胀,同时,嵴膜表面密度明显减少。应用活血健脑胶囊治疗后，海马神经元的损伤较轻,细胞的超微结构基本正常。而脑缺血2h后再灌注6h至12h未用活血健脑胶囊治疗者则神经元超微结构有一定程度的损伤,可见粗面内质网明显扩张并脱颗粒，核糖体和脂褐素颗粒增多，线粒体肿胀,细胞核周间隙稍增宽，异染色质稍增多，异染色质边聚,说明活血健脑胶囊对脑缺血后神经元损伤具有一定修复作用,特别是对线粒体的保护作用较明显。本实验结果中还发现细胞色素C蛋白在缺血2h后再灌注6h的表达主要在海马CA2区和齿状回区。这一结果验证了脑缺血再灌注后的海马神经元凋亡中线粒体依赖凋亡途径的存在。活血健脑胶囊能明显减轻海马神经元的损伤,细胞的超微结构基本正常,细胞色素C蛋白未见增减变化，这可能是因为活血健脑胶囊能够抑制细胞色素C蛋白从线粒体的漏出，阻断细胞凋亡信号的传递，从而抑制细胞凋亡的发生。
有报道［4-5］认为在动物脑缺血模型中，应用Caspase?3抑制剂治疗可以缩小梗塞体积，延长治疗时间窗。本实验显示应用活血健脑胶囊可降低脑缺血/再灌注后脑组织Caspase?3、Caspase?9的活性，说明本方可能作用于Caspase?3前酶，抑制其激活；或直接作用于Caspase?3，从而阻断细胞凋亡的发生。其确切机制有待进一步研究。
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