养血定颤方对帕金森病大鼠行为学、多巴胺能神经元和自由基损伤的影响

【摘要】  目的：探讨养血定颤方帕金森病的作用及机制。方法：采用6?羟基多巴胺单点注射法制备帕金森病大鼠模型,考察养血定颤方对模型大鼠平均转速、TH阳性细胞数和自由基损伤的影响。结果：养血定颤方能显著降低平均转速，增加黑质TH阳性细胞，降低MDA水平,提高SOD、GSH水平。结论：养血定颤方能改善帕金森病大鼠旋转行为，保护受损神经元，其机制与减少自由基损伤有关。

【关键词】  帕金森病 行为学 多巴胺能神经元 自由基损伤 养血定颤方

　帕金森病是一种常见的中枢神经系统变性性疾病，其病理特征是中脑黑质致密部多巴胺能神经元变性缺失。多巴替代疗法虽能改善临床症状，但长期应用会出现“开—关”现象、运动及精神障碍等副作用,且仍无法延缓多巴胺能神经元进行性缺失［1］，因此寻求新的有效治疗手段具有重要意义。养血定颤方系导师张伯礼教授所创新方，治疗帕金森病有较好疗效，本研究旨在观察该方对帕金森病大鼠行为学、受损神经元和自由基损伤的影响，为临床进一步应用提供依据。

　　1     材料与方法

　　1.   1     材料     实验动物Wistar雄性大鼠，体重280～320 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号SCXK(京)2002?2003。药物：6?羟基多巴胺、阿朴吗啡、anti?TH(Sigma公司)，美多芭(上海罗氏制药有限公司)，养血定颤方(自制)，MDA、SOD、GSH试剂盒(南京建成生物工程研究所)。仪器：江湾II型立体定位仪(第二军医大学)，微量进样器(安亭微量进样器厂)，病理图文分析系统(千屏影像工程公司)。

　　1.   2     方法     模型药物配制:以0.   01%VC溶液配制3 μg/μL 6?羟基多巴胺，避光冷藏；模型制备Wistar大鼠45只，禁食12 h，麻醉，消毒，开皮，暴露前囟，固定大鼠，依据大鼠脑立体定位图谱［2］，确定坐标(1.   0 mm，-2.   7 mm, -5.   2 mm)与(1.   0 mm，-2.   7 mm,-6.   0 mm)，打孔，每点注射5 μL造模药物，留针10 min，退针，缝合。另取大鼠15只,同法操作，注射等体积0.   01%VC溶液。模型筛选：术后3周，腹腔注射阿朴吗啡0.   5  mg/kg诱导旋转，40 min平均转速＞7转/min为模型成功大鼠。分组与给药：取模型成功大鼠,随机分为3组，即养血定颤方组、美多芭组和模型组，注射VC溶液大鼠为正常组。4组分别灌胃给予养血定颤方(相当于生药16.   4 g/kg·d)、美多芭(125 mg/kg·d)和生理盐水(正常组和模型组，3 mL/d)，连续4周。平均转速:第7周注射阿朴吗啡诱导旋转，记录40 min平均转速。TH免疫组化：第8周每组取6只大鼠，麻醉，以4%多聚甲醛溶液灌注固定大鼠，取脑，石蜡埋块，切片。常规SABC免疫组化染色(anti?TH稀释比1∶100)。摄片。黑质毁损侧TH阳性细胞计数。自由基损伤：第8周每组取6只大鼠，断头，冰上分离黑质，称重，以冷生理盐水制成匀浆液(质量体积比1∶9)，低温离取上清，考马斯亮兰法测定蛋白含量。按说明书测定MDA、GSH含量和SOD活性。
       
　　统计学处理：所有描述性参数以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析。用SPSS 13.   0软件包进行分析，P<0.   05为差异有显著性。

　　2     实验结果

　　2.   1     各组大鼠平均转速比较     见表1。

　　表1     各组大鼠平均转速比较（略）

　　注：与模型组比较##P<0.   01

　　2.   2     TH免疫组化染色     镜下可见棕色阳性物位于胞浆及突起，正常组细胞饱满，突起完整；模型组突起变短，胞体变圆；养血定颤方组有明显改善，见图1?4。各组大鼠TH阳性细胞数目比较，见表2。

　　图1     正常组TH免疫组化（略）        

　　图2     模型组TH免疫组化（略）         

　　图3     美多芭组TH免疫组化 （略）        

　　图4     养血定颤方组TH免疫组化（略）

　　表2     各组大鼠TH阳性细胞数比较（略）

　　注：与正常组比较##P<0.   01，与模型组比较△△P<0.   01

　　2.   3     各组大鼠黑质MDA、SOD、GSH比较     见表3。

　　表3     各组大鼠黑质MDA、SOD、GSH比较（略）

　　注:与正常组比较##P<0.   01,与模型组比较△△P<0.   01

　　3     讨论
        　　
　　帕金森病(Parkinson?s disease，PD)是老年人常见的神经系统退行性疾病，60岁以上约1%患本病，主要表现为静止性震颤、僵直、少动、姿势障碍等症状。帕金森病的内源性氧自由基中毒假说是由于氧自由基清除系统的缺陷，使黑质、纹状体中氧自由基堆积，过量自由基可以引起生物膜上的不饱和脂肪酸形成过氧化脂质，导致膜流动性降低、通透性增高、线粒体肿胀、溶酶体释放生物酶、细胞器及酶的结构和功能破坏，脂质过氧化物活性增加，生成大量丙二醛，同时引起超氧化物歧化酶活力下降，进一步加重脑组织损伤，以致黑质多巴胺神经元受损而进行性退变［3］。　　多巴胺替代疗法是首选疗法，但多数患者随着时间的延长，药物有效时间会逐渐缩短，终至完全失效［4］。因此寻找新的安全有效的治疗手段具有重要意义。
        　　
　　养血定颤方系导师结合多年临床经验和实验研究成果精心锤炼而成，方中地黄生用，甘寒质润，为补肾要药，白芍养血柔肝、缓急止痛，地、芍合用，酸甘化阴，壮水涵木为君；川芎辛散温通，血中气药，助白芍养血，鳖甲咸寒，血肉有情之品，助生地黄滋阴，共为臣药，全蝎、蝉蜕、僵蚕诸虫药入络搜剔、息风止痉，桑叶、刺蒺藜、珍珠母平肝潜阳，俱为佐使药，诸药合用，滋阴养血以固其本，定痉止颤以蠲其标，并酌加虫类药息风通络，治疗帕金森病有一定疗效，尤其在改善震颤症状、提高患者生活质量等方面疗效显著［5?6］。
        　　
　　本研究采用单点注射法制备帕金森病模型，从模型大鼠平均转速、TH阳性细胞数和自由基损伤等方面考察养血定颤方治疗帕金森病的作用及机制。结果表明养血定颤方能显著降低平均转速，增加黑质TH阳性细胞，降低MDA水平，提高 SOD、GSH水平。上述结果提示养血定颤方能改善帕金森病大鼠旋转行为，保护受损神经元，其机制与减少自由基损伤有关。

【】
  　　［1］Marin C,Aguilar E,Obeso JA.Coadministration of entacapone with levodopa attenuates the severity of dyskinesias in hemiparkinsonian rats［J］.Mov Disord,2006,21:646?653.

　　［2］Paxinos G,Watson C.The rat brain in stereotaxic coordinates［M］.5th Edition,2005,Electronic press:128?140.

　　［3］Holtz WA,Turetzky JM,Jong YJ,et al.Oxidative stress?triggered unfolded protein response is upstream of intrinsic cell death evoked by parkinsonian mimetics［J］.JNeurochem,2006,99(1):54?69.

　　［4］J aoaquim J F,Claire T,Jean LM,et al.Levodopa monotherapy can induce sleep attacks in Parkinson’s disease［J］.J Neurol,2001,248(1):4261.

　　［5］陈 敏.补肾止颤汤治疗帕金森病临床观察［J］.吉林中医药,2005,25(9):12?13.

　　［6］袁建平,王秀丽,陈 东.中西医结合治疗帕金森氏病60例［J］.吉林中医药,2005,25(11):47.