高丽参多糖GPⅡ分离纯化、组成和抗氧化活性研究
【摘要】 目的：从高丽参中提取出水溶性粗多糖GP，经分离纯化得到GPⅡ，研究GPⅡ的纯度、性质和体外抗氧化能力。方法：粗多糖经Sevage法脱蛋白，DEAE Sepharose CL?6B柱层析分离纯化得到GPⅡ，经HPLC和醋酸纤维素薄膜电泳法检验纯度，GC分析它的单糖组成，超氧阴离子清除实验和羟自由基清除实验等鉴定其抗氧化能力。结果：GPⅡ是均一组分多糖，它的单糖组成是葡萄糖。结论：GPⅡ有高于维生素C的羟自由基清除作用和超氧阴离子清除作用，以及相当于维生素C的邻苯三酚自氧化抑制作用。
【关键词】 高丽参；水溶性粗多糖；分离纯化；抗氧化活性
本文对高丽参粗多糖进行分离纯化，并对它的组成成分等性质以及体外抗氧化活性进行了研究。
1 实验材料
高丽参［1］:购于辽宁丹东。氯化硝基氮蓝四唑(NBT)，吩嗪硫酸甲酯(PMS)，脱氧核糖，硫代巴比妥酸(TBA)及还原型辅酶I (NADH·2Na)，标准品为Sigma公司试剂；DEAE?sepharose CL?6B为Pharmacia公司产品；其他试剂均为上海化学试剂有限公司分析纯。MC99?2自动核酸蛋白分离层析仪，上海沪西分析仪器厂；高效液相色谱，安捷伦HP1100；气相色谱仪，安捷伦6890N。
2 实验方法
2.1 高丽参粗多糖的提取
准确称取高丽参250 g，加入一定体积80%乙醇，在50℃水浴中回流提取6 h，间隙搅拌。提取完毕，过滤，残渣烘干用于热水提取。将上述残渣50 g加入3 000 mL的蒸馏水，封口，在80℃恒温水浴下提取2 h，过滤，将滤液合并，60℃ 减压旋转蒸发浓缩至小体积，离心，弃去沉淀物，上清液加入4倍体积无水乙醇进行醇沉，放置4℃冰箱中过夜。次日离心10 min(3 000 r/min)，取沉淀，常规干燥(沉淀分别用无水乙醇和无水乙醚洗涤1次，置于真空干燥器内干燥)得粗多糖GP。
2.2 粗多糖的分离与纯化［2?3］
3%粗多糖溶液，按照酶?Sevage法联合脱蛋白，至无游离蛋白为止。500 mg脱蛋白后的GP溶于10 mL蒸馏水，采用DEAE?Sepharose CL?6B柱层析制备，先后用蒸馏水和0～1M NaCl进行洗脱。
2.3 多糖样品纯度鉴定方法
多糖样品的纯度鉴定采用高效液相色谱法和醋酸纤维素薄膜电泳法。高效液相色谱柱为SUGAR KS?804，水作流动相，流速1 mL/min，柱温50℃，示差检测器检测。
2.4 多糖性质分析［4］
红外光谱分析确定样品是否含有多糖的特征吸收峰;采用气相色谱法分析单糖组成。分子量测定采用高效液相色谱法,色谱柱为SUGAR KS?804。测出各标准样品(T?10、T?40、T?70、T?500、蓝色葡聚糖、葡萄糖)及待测样品的保留时间。
2.5 体外抗氧化活性的测定［4?5］
超氧阴离子清除能力实验用样品浓度为0(对照)、0.78、1.56、3.125、6.25、10、20、40、50、80 mg/mL。羟自由基清除作用实验用样品浓度为0(对照)、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.3、12.5、25、50 mg/mL。对邻苯三酚自氧化的抑制测定实验用样品浓度为0(对照)、5、10、40、80 mg/mL。
3 结果与分析
3.1 粗多糖的提取与分离纯化
高丽参经水提取，粗多糖GP得率为28.05%。GP经DEAE?Sepharose CL?6B蒸馏水洗脱曲线如图1所示。
由图1可以看出，GP的蒸馏水洗脱液在490 nm下检测到2个糖峰。借助糖峰来收集洗脱液。收集54～80管洗脱液，浓缩，醇沉，沉淀常规干燥，命名为GPⅡ。GP的NaCl梯度洗脱液经苯酚-硫酸检测含有一个糖洗脱峰，暂且不做分析。
3.2 GPⅡ的纯度鉴定
配制0.1%的样品液，0.4 μm纤维素膜过滤，进样量20 μL。GPⅡ的高效液相色谱结果(图2)检测出一条峰，证明GPⅡ是纯度较好的样品。GPⅡ在醋酸纤维素薄膜电泳上均跑出来一条区带，再次验证GPⅡ为成分单一的多糖。
3.3 GPⅡ的性质分析
GPⅡ的保留时间是6.291,查标准曲线(Y=-3.913 X+6.318 3;R2=0.990 6)，得GPⅡ的分子量是30万左右。红外光谱分析表明, 它在3 600～3 200 cm有-OH吸收峰,在2 923 cm左右有一强的吸收峰,为-CH、-CH2的共振吸收峰，在1 635 cm左右有多糖的水合振动峰。GPⅡ经酸水解，衍生化后的气相色谱结果如图3所示，对照标准单糖的气相色谱图，中间峰代表内标甘露醇，得出GPⅡ由葡萄糖组成。
3.4 GPⅡ的体外抗氧化活性
从图4可以看出,GPⅡ体外有显著的超氧阴离子清除作用,整个反应体系含0.3 mg样品时,即显示抑制超氧阴离子的能力,随着提取物质量浓度的升高,抑制作用也逐渐加强,呈现量效关系。相对维生素C而言，在反应体系含样品量小于5 mg时，GPⅡ显示更高的超氧阴离子清除活性，大于5 mg时，GPⅡ和维生素C对超氧阴离子的清除作用相当。
从图5可以看出,GPⅡ体外有显著的抑制羟自由基的作用,整个反应体系含0.32 mg时,GPⅡ即显示抑制羟自由基的能力。相对维生素C而言，GPⅡ有稍强的羟自由基清除作用。
GPⅡ对邻苯三酚自氧化速率的抑制作用，结果见图6。从图6可知GPⅡ能够清除邻苯三酚自氧化反应所产生的活性氧，其抑制率随反应体系含GPⅡ量的增加而加大，GPⅡ对邻苯三酚自氧化的抑制作用相当于维生素C。
4 结论
为除去高丽参中皂甙、单糖、双糖、低聚糖等物质，我们用80%乙醇回流对高丽参进行预处理，得到的残渣烘干后用水煮提取，得高丽参粗多糖。粗多糖经脱蛋白，DEAE Sepharose CL?6B 柱层析分离纯化后在蒸馏水洗脱部分得GPⅡ。通过高效液相色谱和醋酸纤维素薄膜电泳鉴定，GPⅡ是纯度较好的样品。分子量研究表明GPⅡ的分子量是30万左右，气相色谱研究表明，GPⅡ由葡萄糖构成。对高丽参多糖GPⅡ的体外抗氧化活性进行研究表明，GPⅡ显示高于维生素C的羟自由基清除作用和超氧阴离子清除作用，以及相当于维生素C的邻苯三酚自氧化抑制作用。
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