五种中药制剂体外抗呼吸道病毒效果及细胞毒性的研究
【摘要】 目的 了解5种中药制剂体外抗流感病毒、柯萨奇病毒和呼吸道合胞病毒的效果，为抗病毒性感冒新药研发提供依据。方法 建立流感病毒感染MDCK细胞、柯萨奇病毒和呼吸道合胞病毒感染Vero E6细胞的模型，以细胞病变效应(CPE)为观察指标，了解不同浓度5种中药制剂体外抗病毒效果及细胞毒性。实验中以病毒唑作为对照药。结果 1～5号中药制剂对MDCK细胞未出现细胞毒性的最小稀释度分别为1∶20、1∶40、1∶20、1∶80和1∶400，对Vero E6细胞则为1∶40、1∶80、1∶20、1∶20和1∶100。1～5号中药制剂出现对流感病毒的IC50值分别为1∶200、1∶100、1∶400、1∶200和1∶400，对柯萨奇病毒的IC50值分别为1∶50、1∶50、1∶100、1∶200和1∶200，对呼吸道合胞病毒的IC50值分别为<1∶25、<1∶50、1∶200、<1∶25和1∶100。结论 综合药效和细胞毒性实验结果，3号中药制剂可以作为抗病毒性感冒新药的首选制剂，其次为4号中药制剂。
【关键词】 中药制剂; 抗病毒作用; 呼吸道病毒; 细胞病变效应; 细胞毒性
Abstract：Objective To determine the anti-respirovirus effects in vitro and cytotoxicuty of five Chinese drug preparations. Method The models of influenza virus infecting MDCK cells, coxsackie virus and respiratory syncytial virus infecting Vero E6 cells were established in this study. By using cytopathic effect (CPE) as the index, the antivirus effects in vitro and cytotoxicity of five Chinese drug preparations were investigated. In these tests, ribavirin was used as the control. Results The minimal dilutions not presenting cytotoxicity to MDCK cells of No.1~5 Chinese drug preparations were 1∶20, 1∶40, 1∶20, 1∶80 and 1∶400, while that to Vero E6 cells were 1∶40, 1∶80, 1∶20, 1∶20 and 1∶100, respectively. The IC50 values of No.1~5 Chinese drug preparations to influenza virus were 1∶200, 1∶100, 1∶400, 1∶200 and 1∶400 dilutions, while that to coxsackie virus were 1∶50, 1∶50, 1∶100, 1∶200 and 1∶200 dilutions, and that to respiratory syncytial virus were <1∶25, <1∶50, 1∶200, <1∶25 and 1∶100 dilutions, respectively. Conclusions Combining the experimental results of drug actions and cytotoxicities, firstly the No.3 preparation and followed No.4 preparation can be used for developing new anti-viral cold drugs.
Key words：Chinese drug preparations; antivirus effect; respirovirus; cytopathic effect; cytotoxicity 天然药物有许多化学药物不具备的优点，如毒副作用小、不易诱导耐药性等。中药是天然药物重要来源之一。我国的中药资源极为丰富，应用悠久，在长期的实践中积累了很多资料和经验[1, 2]。相对于抗菌药物而言，目前临床上使用的抗病毒药物种类少，疗效也不十分确定。因此，从中药中筛选具有抗病毒作用的中药制剂或有效成分是研制新型抗病毒药物的有效途径之一。本次研究对养生堂研制的5种抗病毒中药制剂的体外抗流感病毒、柯萨奇病毒和呼吸道合胞病毒的作用进行了观察，以期为进一步开发提供药效学依据[3]。
1 材料与方法
1.1 受试药物来源和配制 受试的5种中药制剂均由养生堂提供。对照药病毒唑由江苏省宿迁市制药厂生产。五种中药制剂临用前均经121℃ 15min高压灭菌，冷却后置4℃备用。5种中药制剂和病毒唑分别用含2.5%小牛血清DMEM培养液(GiBco)稀释为工作液。
1.2 细胞株及培养 MDCK和Vero E6细胞均由浙江大学医学院病原生物系提供。培养基为含10%小牛血清DMEM(GiBco)。
1.3 病毒株 流感病毒A3(H3N2)株购自医学院病毒研究所，柯萨奇病毒B4株和呼吸道合胞病毒E6株均购自中国科学院武汉病毒研究所。
1.4 50%组织细胞感染剂量的测定 各病毒株用2.5%小牛血清DMEM稀释成不同浓度的病毒液。流感病毒接种MDCK细胞，柯萨奇病毒B4株和呼吸道合胞病毒E6株接种Vero E6细胞，37℃培养7 d后观察感染细胞圆缩、脱落等细胞病变(cytopathic effect, CPE)情况，以测定各病毒引起50%组织细胞病变的感染剂量(50% tissue culture infective dose, TCID50)。
1.5 药物的细胞毒性试验 分别将不同稀释度的5种中药制剂(1∶10～1∶1600)和对照药病毒唑(50μg /ml～800μg /ml)工作液加入96孔培养板MDCK和 Vero E6单层细胞中，不同稀释度各药物均重复3孔，另设置3孔不加任何药物的正常细胞对照，5%CO2、37℃中培养7 d，每天观察CPE一次，以不出现细胞病变的药物最小稀释度为细胞毒性判断终点。
1.6 抗病毒试验 在96孔培养板的MDCK单层细胞中加入终浓度为100 TCID50流感病毒液，Vero E6单层细胞中分别加入终浓度为100 TCID50柯萨奇病毒液和呼吸道合胞病毒液，37℃孵育1 h。吸弃病毒液，用无血清DMEM液洗涤两次，然后分别加入不同浓度各中药制剂和病毒唑工作液，不同稀释度各药物均重复3孔。实验中设置感染等量病毒不给药的感染对照和无病毒感染的正常对照。各培养板5%CO2、37℃培养7 d，每天观察CPE一次。应用Reed-Muench法各药物的50%细胞病变抑制浓度(50% inhibiting concentration, IC50)，以药物最高稀释度出现的IC50值作为抗病毒效果判断的终点。
2 结果
2.1 各病毒TCID50值 流感病毒接种MDCK细胞后约5 d出现CPE，柯萨奇病毒B4株和呼吸道合胞病毒E6株接种Vero E6细胞后分别约2 d和约4 d出现CPE。流感病毒A3的TCID50为1×103/ml，柯萨奇病毒B4和吸道合胞病毒E6的TCID50均为1×105/ml。
2.2 药物的细胞毒性 在受试时间内，正常对照孔的细胞形态正常。5种中药制剂和病毒唑对MDCK细胞和Vero E6细胞的细胞毒性试验结果见表1，其中1号和3号中药制剂的细胞毒性较小，2号和4号中药制剂的细胞毒性中等，5号中药制剂的细胞毒性较大。
2.3 不同药物抗病毒效果在受验时间内正常对照孔细胞形态均正常，各病毒感染对照孔细胞分别在预计的时间内出现明显的CPE。实验结果表明，3号和5号中药制剂抗流感病毒、柯萨奇病毒和呼吸道合胞病毒感染的作用较强，4号中药制剂体外抗病毒作用中等，1号和2号中药制剂抗病毒作用较弱，病毒唑体外抗上述病毒感染的IC50低于100 μg/ml(表2)。实验中还发现，除3号制剂外，其余几种中药制剂各体外抗呼吸道合胞病毒的作用均较抗流感病毒和柯萨奇病毒为弱。
3 讨论
病毒感染性疾病约占传染病的70%，因而是威胁人类健康和生命的主要传染病。20世纪90年代以来，发现了不少新的抗病毒药物，目前在临床上应用的抗病毒药物已超过20余种，但其确切疗效仍有很大争议[4]。此外，抗病毒化学合成类药物长期应用后，病毒易对其产生耐药性，已成为临床上病毒性疾病中的棘手问题。认为，一些中药不仅具有抑制病毒复制、阻止病毒致细胞病变等直接的抗病毒作用，还有调节免疫功能、镇痛抗炎等综合功效，故中药在防治病毒感染性疾病方面具有独特的优势和广阔的前景。
在新药研制过程中，药效是首先必须确定的指标。流感病毒、柯萨奇病毒和呼吸道合胞病毒是最为常见的呼吸道感染病毒，故可作为抗病毒性感冒新药研究的靶病毒。本次研究中证实，5种中药制剂体均有体外抗流感病毒、柯萨奇病毒和呼吸道合胞病毒的作用，但以3号和5号中药制剂抗病毒的作用较强，4号中药制剂次之，1号和2号中药制剂抗病毒作用较弱。细胞毒性试验结果显示，1号和3号中药制剂的细胞毒性较小，2号和4号中药制剂的细胞毒性次之，5号中药制剂的细胞毒性较大。综合药效和细胞毒性实验结果，3号中药制剂可以作为抗病毒性感冒新药的首选制剂，其次为4号中药制剂。
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1 干振华，李金恒. 中药抗病毒药理作用的研究进展[J]. 医学研究生学报，2007, 20(12): 1290-1293.
2 王玮，高永翔. 中药抗病毒研究进展 [J]. 中西医结合杂志，2008, 17(17): 2753-2754.
3 中华人民共和国卫生部药政局. 新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学、药、毒理学)[M]. 1993. 215.
4 张致平. 微生物药物学 [M]. 北京：化学出版社，2003.405.
