白藜芦醇对肝癌细胞基质金属蛋白酶?9表达的影响
作者：余海波, 潘承恩, 吴武军, 赵四海, 张慧峰
【摘要】 目的：观察白藜芦醇（resveratrol, Res）对体外人肝癌细胞系SMMC?7721细胞增殖及基质金属蛋白酶?9（matrix metalloproteinase?9, MMP?9）表达的影响，初步探讨Res抑制肝癌细胞侵袭转移的机制。方法：应用不同浓度的Res分别作用于人肝癌细胞系SMMC?7721细胞24、48和72 h，采用甲基噻唑基四唑比色试验（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）观察Res对SMMC?7721细胞增殖的影响；反转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT?PCR）检测MMP?9 mRNA的表达；蛋白印迹分析（Western blot analysis）法检测MMP?9蛋白表达情况。结果：Res对SMMC?7721细胞有增殖抑制作用，且呈量效和时效关系；经Res作用后，SMMC?7721细胞MMP?9 mRNA和蛋白表达均明显下降（P＜0.05）。结论：Res对肝癌细胞的生长具有抑制作用，且能下调其MMP?9的表达，可能具有抑制肝癌细胞侵袭转移的作用。
【关键词】 白藜芦醇; 肝癌; 基质金属蛋白酶?9
Objective: To observe the effects of resveratrol on proliferation of human hepatocellular carcinoma cell line SMMC?7721 cells and expression of matrix metalloproteinase?9 (MMP?9) in vitro.
Methods: SMMC?7721 cells were treated with different concentrations of resveratrol for 24, 48 and 72 h, respectively. The effect of resveratrol on proliferation of SMMC?7721 cells was assessed with methyl thiazolyl tetrazolium (MTT). The expression of MMP?9 mRNA was determined by reverse transcription polymerase chain reaction (RT?PCR). MMP?9 protein was identified by Western blot analysis.
Results: Resveratrol could inhibit the proliferation of SMMC?7721 cells with dose? and time?dependent effects. Moreover, both MMP?9 mRNA expression and MMP?9 protein production were markedly reduced after resveratrol treatment.
Conclusion: Resveratrol can inhibit the proliferation of SMMC?7721 cells and down?regulate MMP?9 expression. It is presumed that resveratrol may suppress the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma.
Keywords: resveratrol; liver cancer; matrix metalloproteinase?9
原发性肝癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，术后5年生存率低，仅为25%～39%［1］。侵袭转移是影响肝癌预后的主要因素。因此，阐明肝癌侵袭转移的发生机制，寻求有效的抗侵袭转移措施，对改善肝癌患者预后具有重要意义。白藜芦醇（resveratrol, Res）是一种从葡萄、虎杖等植物中分离提取的一种多酚类化合物。近年来的研究表明，Res有抗炎、抗氧化、改善微循环和调节脂质代谢等众多生物学活性。深入研究发现其具有抗肿瘤作用［2］，特别是对于肝癌细胞，Res有明显的抑制增殖和诱导凋亡的作用，但目前鲜有抑制肝癌侵袭转移的报道。本实验通过研究Res影响肝癌细胞生长和基质金属蛋白酶?9（matrix metalloproteinase?9, MMP?9）表达的情况，初步探讨了Res抑制肝癌细胞侵袭转移的可能性。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞株 人肝癌细胞株SMMC?7721为西安大学医学院第一附属肝胆外科实验室传代保存，接种于含有10%新生牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI 1640培养液中，在37 ℃、5% CO2及完全饱和湿度条件下培养，取对数生长期细胞进行实验。
1.1.2 试剂 Res购自美国Sigma公司；优级新生牛血清，购自兰州民海生物工程有限公司；RPMI 1640培养基，购自美国Gibco公司；逆转录试剂盒、PCRMix及蛋白marker购自Invitrogen公司；鼠抗人MMP?9抗体购自美国Neomarker公司，羊抗鼠二抗购自深圳晶美公司。
1.2 实验方法
1.2.1 甲基噻唑基四唑比色试验 取对数生长状态良好的SMMC?7721细胞，制备细胞悬液，调整细胞浓度后加入96孔板，使每孔细胞数达到5×103，培养24 h贴壁后无血清培养基同步培养24 h。然后加入终浓度分别为10、50、100、200、500 μmol/L Res的RPMI 1640培养基，并同时设空白对照孔和阴性对照孔，每组设4个复孔。作用24、48、72 h后，每孔分别加入5 mg/ml甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）20 μl，37 ℃孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜。平板摇床轻微振荡10 min使结晶溶解，应用Bio?Rad全自动酶标仪于波长490 nm处测得每孔的吸光度（optical density, OD）。实验重复3次。细胞生长抑制率。细胞生长抑制率=［1－（实验组OD－空白对照组OD）/（阴性对照组OD－空白对照组OD）］×100%。
1.2.2 反转录聚合酶链反应 SMMC?7721细胞常规消化后以105/ml加入各培养瓶，常规培养24 h后贴壁。更换无血清培养基同步培养24 h。然后加入含有不同浓度Res的RPMI 1640培养基培养24 h，收集各组处理的细胞，用Trizol试剂一步法提取细胞的总RNA，逆转录合成cDNA。取1 μl cDNA产物、12.5 μl PCRMix、MMP?9和磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH）上下游引物及缓冲液等共25 μl进行聚合酶链（polymerase chain reaction, PCR）扩增。引物由Primer引物设计软件设计，北京奥科生物工程有限公司合成，PAGE纯化。MMP?9上游引物：5'?TCC CTG GAG ACC TGA GAA CC?3'，下游引物：5'?CGG CAA GTC TTC CGA GTA GTT?3'，扩增片断长度308 bp；GAPDH上游引物：5'?TCC TGC ACC ACC AAC TGC TT?3'，下游引物：5'?TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA?3'，扩增片断长度527 bp。实验重复3次。PCR产物经1.5%琼脂电泳，用凝胶成像分析系统分析结果，以MMP?9基因片段与GAPDH片段灰度值的比值作为其相对表达水平数值。
1.2.3 蛋白印迹分析 收集各组处理细胞，每5×106细胞加200 μl细胞裂解液，吹打并剧烈振荡30 min，12 000 r/min 离心10 min，收集上清液100 ℃加热5 min变性，测浓度分装备用。分别制备12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis, SDS?PAGE）分离胶和5% SDS?PAGE浓缩胶。上样30 μg后电泳，然后恒流300 mA转膜75 min。转移后的硝酸纤维素（nitrocellulose, NC）膜经5%脱脂奶粉室温封闭1 h，然后与1∶1 000鼠抗人MMP?9抗体4 ℃孵育过夜，接着加1∶1 000标记的羊抗鼠抗体，室温反应90 min，化学发光法检测，暗室压片曝光，显影定影后胶片保存并进行灰度分析，应用Genetools分析软件，MMP?9阳性条带密度与β?actin条带密度的比值即为相对表达量。实验重复3次。
1.3 统计学方法 所有实验数据均采用SPSS 12.0软件进行统计学分析，计量资料用x±s表示，采用析因设计的方差分析，两样本均数比较采用成组t检验，以P<0.05作为具有统计学意义的标准。
2 结果
2.1 Res对SMMC?7721细胞增殖的抑制作用 倒置显微镜下观察，未用药组细胞贴壁良好，形态正常；用药组细胞随药物剂量增大，细胞核与细胞质比值减小，胞质内出现大小不等的空泡，细胞活力降低，部分不能贴壁。MTT实验结果显示，SMMC?7721细胞增殖抑制率随Res浓度的增高和作用时间的延长而逐渐升高，呈现明显的量效和时效关系。见表1。
2.2 Res对SMMC?7721细胞MMP?9转录表达的影响 通过反转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT?PCR）检测，在SMMC?7721细胞中有MMP?9（308 bp）产物，Res作用24 h后，MMP?9 mRNA表达明显低于药物作用前，且随着剂量的增加，mRNA的表达降低（P<0.05）。见图1。
2.3 Res对SMMC?7721细胞MMP?9蛋白表达的影响 蛋白印迹法检测发现，在Res作用24 h后，SMMC?7721细胞MMP?9蛋白的相对表达强度随着Res剂量的增加明显降低，与空白组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。
表 1 白藜芦醇对人肝癌细胞系SMMC?7721细胞的增殖抑制作用（略）
Table 1 Growth?inhibition of resveratrol on human hepatocellular carcinoma cell line SMMC?7721
图1 Res抑制SMMC?7721细胞MMP?9 mRNA表达的情况（略）
Figure 1 Inhibition of Res on expression of MMP?9 mRNA in SMMC?7721 cells
A: MMP?9 mRNA expression under different concentrations of Res treatment for 24 h; B: Relative content of MMP?9 mRNA level.
图2 Res抑制SMMC?7721细胞MMP?9蛋白表达的情况（略）
Figure 2 Inhibition of Res on MMP?9 protein expression in SMMC?7721 cells
A: MMP?9 protein expression under different concentrations of Res treatment for 24 h; B: Relative content of MMP?9 protein level.
3 讨论
侵袭和转移是恶性肿瘤基本的特性，是一个多因素、多步骤、多阶段的复杂过程［3］，肿瘤侵袭和转移的天然屏障细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的降解和基底膜（basement membrane, BM）的破坏是其中一个关键的步骤。肿瘤细胞通过自身或诱导宿主细胞产生多种基质蛋白溶解酶，如MMP、纤溶酶原激活物和胱氨酸蛋白酶等，能降解ECM和BM。在这种降解作用中，MMP家族是关键因素之一。MMP?9是MMP家族中具有代表性的一个因子，与肿瘤的侵袭转移有密切的关系。有研究表明［4，5］，肿瘤组织中MMP?9表达与肝癌患者的术后复发密切相关，为预测肝癌患者术后复发的指标之一，所以抑制MMP?9的表达是抑制恶性肿瘤侵袭转移，实现带瘤生存的手段之一。
Res药理作用广泛，对多种肿瘤细胞具有抑制作用，在癌细胞突变、促癌及演进各阶段均可发挥积极的拮抗作用，但机制并不十分清楚。有研究表明，Res对多种人类肿瘤细胞有促进凋亡的作用，机制包括促进caspase活性增加，使肿瘤细胞周期停滞于G1期或阻止细胞周期由S期进入G2期，降低cyclin D1和CDK4蛋白的表达，增加Bcl?2和Bcl?xl表达，上调Bax和细胞周期素依赖的蛋白激酶（cyclin?dependent kinase, CDK）抑制剂诱导因子p21等［6?8］。
Res在其他系统恶性肿瘤中有抑制肿瘤细胞MMP?9表达的作用，例如Res能抑制多发性骨髓瘤细胞的MMP?9蛋白表达和活性［9］，Res也可以通过抑制c?Jun氨基末端激酶（jun N?terminal kinases, JNK）和蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）信号传导通路降低宫颈癌细胞的MMP?9表达［10］。但目前尚未发现其对肝癌细胞MMP?9表达影响的报道。本实验通过不同浓度Res对SMMC?7721细胞生长以及MMP?9转录和蛋白表达的影响，观察了Res抑制肝癌细胞生长和侵袭转移的情况。本实验结果发现，不同浓度的Res作用于SMMC?7721细胞24 h，随着Res浓度的增加，细胞生长抑制率逐渐增加，200 μmol/L Res细胞增殖抑制率＞50%；同时我们的研究结果也表明，肝癌细胞在受到Res的作用后，MMP?9蛋白的表达强度明显降低，说明Res可能具有调控MMP?9蛋白表达的功能；在Res作用24 h后，肿瘤细胞的MMP?9 mRNA表达也显著降低，提示Res可能是通过下调MMP?9 mRNA的表达而降低其蛋白的翻译合成，进而降低对肿瘤周围基质以及基底膜的溶解，使细胞向周围组织侵袭的能力降低。国外研究表明，MMP?9基因启动子有几个可以与活化或转录因子相结合的位点，包括活化蛋白?1（activator protein?1, AP?1）和核转录因子?κB（nuclear factor?kappaB, NF?κB）的结合位点，这些活化因子的结合是MMP?9表达必需的［11］。Res通过抑制NF?κB的活性来抑制血液系统肿瘤MMP?9的表达［12］，Res能通过激动过氧化物酶体增生物激活受体抑制细胞外基质金属蛋白酶诱导因子的表达，从而抑制MMP?9的表达［13］。Res是否通过AP?1或NF?κB途径间接下调肝癌MMP?9的表达尚待进一步研究。
【】
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