脑心康片对大鼠脑缺血再灌注损伤后凋亡相关基因细胞间黏附分子表达的影响

                   作者：苏云明　张学会　李环　李卉　孟妍 

【摘要】  目的观察脑心康片对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，进一步探讨其作用机制。方法Wistar大鼠雄性70只，按照体重随机分为7组，每组10只。即脑心康片高剂量组、中剂量组、低剂量组，尼莫地平组，银杏叶片组，模型组和假手术组。各组均连续灌胃给药7 d（模型组和假手术组予等体积生理盐水）。末次给药30 min后，除假手术组外各组采用大鼠大脑中动脉线栓法制备不完全脑缺血模型，观察脑心康片给药前后大脑中动脉阻塞(MCAO)大鼠神经功能缺损导致的行为学变化；免疫组织化学法检测脑心康片对脑缺血后24，48，72 h脑组织细胞间黏附分子-1（ICAM-1）蛋白表达的影响。结果脑心康片能明显改善脑缺血大鼠的神经功能缺损症状，抑制ICAM-1蛋白的表达。结论脑心康片对脑缺血具有保护作用，遵循一定的时-效关系和量-效关系，其机理可能与脑心康片通过抑制凋亡相关基因的表达，进而抑制神经元细胞凋亡有关。

【关键词】  脑心康片；脑缺血；再灌注损伤；细胞凋亡； 细胞间黏附分子-1

　　Abstract:ObjectiveTo study the protective effect of Naoxinkang-tablet on cerebral ischemia reperfusion injury in rats and its mechanism.MethodsThe model of incomplete cerebral ischemia were induced by occluding the middle cerebral artery occlusion (MCAO). The protein expression of ICAM-1 was immunohistochemical method at 24 h, 48 h and 72 h after cerebral ischemia.ResultsNaoxinkang-tablet could obviously improve detected by symptoms of the neurological deficit in cerebral ischemia rats, inhibit the expression of ICAM-1. ConclusionNoxinkang-tablet has protective effect on cerebral ischemia reperfusion injury in time and dose dependent manners by inhibiting ICAM-1 expression and anti-inflammation.

　　Key words:Naoxinkang-tablet；Cerebral Ischemia；Reperfusion injury；Cell Apoptosis；  ICAM-1

    脑血管疾病是神经系统的常见病、多发病，是目前引起人类死亡的三大疾病之一。缺血性脑卒中是多种原因引起的一种临床病理状态,其脑组织损害是产生临床征象的病理基础。在本病的预防、和康复方面，中医药具有较为显著的疗效和优势。临床应用脑心康片治疗脑缺血，取得满意疗效［1］。本实验通过对大鼠脑神经损伤的行为学改变、凋亡相关基因ICAM-1蛋白表达的观察，探讨脑心康片对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用及其作用机制。现报道如下。

　　1  材料与仪器

　　1.1  动物

　　Wistar大鼠，雄性，体重（200±20）g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：黑动字P00101006。大鼠自由进食、饮水，同等条件下饲养，手术前12 h禁食，不禁水。

　　1.2 药品与试剂

　　脑心康片由蝙蝠葛酚性碱50%、水蛭素50%组成，黑龙江中医药大学实验中心制备；尼莫地平片，天津中央药业有限公司生产，批号0701001；银杏叶片，唐山荣大药业有限公司生产，批号050304。Rabbit Anti CD54（ICAM-1）（BA2189），稀释度：1∶100（武汉博士德生物工程有限公司）。HRP标记的链霉卵白素-亲和素SP试剂盒、 S/P三步法检测试剂盒（批号50881774）、PV6001二步法检测试剂盒（批号1360）、兔抗山羊IgG/HRP（批号C0206）、 山羊抗鼠IgG/HRP（批号N045036）、 DAB显色试剂盒  （批号60882801），均有北京中杉金桥生物技术有限公司生产。

　　1.3 仪器

　　生物组织摊烤片机、生物组织包埋机（湖北孝感）；电热鼓风干燥箱（上海福玛）；光学显微镜（Olympus Japan BH-2）；Q500IW图像分析仪（ 德国Leica）；医用图像分析处理系统（华海有限公司）。

　　2 方法

　　2.1 分组及给药方法

　　清洁级雄性Wistar大鼠70只，体重（200±20）g，按照体重随机分为7组，每组10只。即脑心康片高剂量组（100 mg/kg），脑心康片中剂量组（50 mg/kg），脑心康片低剂量组（25 mg/kg），尼莫地平治疗组（21.6 mg/kg），银杏叶片组（135 mg/kg），模型对照组和假手术组（分别给等体积生理盐水）。各组均连续灌胃给药7 d，末次给药30 min后手术。

　　2.2 大鼠脑缺血再灌注模型制备

　　采用大鼠大脑中动脉线栓法制备不完全脑缺血模型，末次给药30 min 后，用10%水合氯醛350 mg·kg-1行腹腔注射麻醉，分离并结扎双侧颈总动脉及迷走神经45 min，然后松开再灌注2 h。假手术组只暴露血管不结扎，其余组均按照上述过程操作。

　　2.3 实验指标的检测方法

　　在造模手术完成3～5 h，待大鼠苏醒后，能够完全自主活动时，进行第1次神经功能评分；分别于末次给药后24，48，72 h进行第2次神经功能评分。行为学评分后处死部分动物，快速开胸暴露心脏，剪开右心耳，经左心室插管至升主动脉内，于5 min内快速灌注150 ml左右肝素化生理盐水；随后滴注含4%多聚甲醛的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液200 ml缓慢灌注固定；灌注完毕，完整取脑，在相同固定液中4℃固定24 h。采用免疫组织化学法检测大鼠脑组织ICAM-1蛋白表达。

　　2.4 统计方法所有数据以±s表示，组间比较用t检验。

　　3 结果

　　3.1 脑心康片给药前后各组大鼠神经功能缺损评分情况结果见表1。表1  各组大鼠神经功能缺损评分的基本情况（略）

    由表1可见，模型组与假手术组相比，差异有显著性意义（P<0.01）；给药后脑心康片高、中、低剂量组与银杏叶片组相比，差异有显著性意义（P<0.01或P＜0.05）；给药后脑心康片高、中、低剂量组与尼莫地平组相比，差异均有显著性意义（P<0.01或P<0.05）。

　　3.2 脑心康片对MCAO大鼠脑组织ICAM-1表达的影响

　　结果见表2及图1。表2  脑心康片对MCAO大鼠脑组织ICAM-1表达的影响（略）

    由表2可见，给药各组和模型组与假手术组相比，差异有显著性意义（P<0.01）。从药物作用强弱对比看，脑心康片高剂量在3个用药时间段抑制的作用与尼莫地平组相当，两组比较，差异有显著性意义（P＜0.05），明显优于银杏叶片组，两组比较，差异也有显著性意义（P＜0.05或P＜0.01）；脑心康片中、低剂量在3个时间点抑制作用与尼莫地平组相当或略弱（P＜0.05），但与银杏叶片给药组比较，差异无显著性意义（P＞0.05）。脑心康片同一时间点的高、低剂量组比较差异显著（P＜0.01）；且脑心康片高、中、低剂量用药72 h的作用优于给药24 h的作用，差异有显著性意义（P＜0.05）。
  
　　3个时间点，所有药物组与模型组及假手术组比较，均有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01）。

    脑组织切片中，ICAM-1免疫阳性染色见于梗死灶周围脑组织内微血管和毛细血管的内皮细胞，表现为血管壁内皮细胞棕黄染色。假手术组极少见ICAM-1阳性染色血管；模型对照组及药物治疗组均有不同程度ICAM-1阳性反应血管。模型对照组在24，48，72 h内阳性染色血管随时间推移，逐渐减少，但与假手术组比较均有显著性差异（P＜0.01），说明在缺血24 h后，ICAM-1表达达到高峰后，持续高位表达，脑缺血部位炎症反应较重（见图2～8）。
    
　　4 讨论

    脑缺血时神经细胞凋亡的发生机制目前仍不十分清楚。但大量的研究表明，缺血脑组织神经细胞凋亡受基因调控，并发现了许多与神经细胞凋亡密切相关的调控基因，主要有Caspase家族、Bcl-2蛋白家族、ICAM、IEGs和p53基因等［2］。ICAM-1是Rothelein等于1986年首次发现鉴定的一种淋巴细胞功能相关抗原-1的配体，是一种单链跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族［3］。ICAM-1可介导白细胞与血管内皮细胞之间的粘附以及白细胞穿出血管壁。ICAM-1在静息的白细胞、内皮细胞上呈低水平表达，但在致炎性细胞因子刺激下表达可迅速上调，并以血管内皮细胞表达最强［4］。急性脑缺血时，在炎性细胞因子的刺激下，ICAM-1的表达显著升高，与白细胞表面表达的配体CD11α/CD18和CD11b/CD18相结合，介导白细胞与血管内皮细胞之间的粘附，导致微循环障碍，发生无复流现象，并介导白细胞游出血管，产生FR、炎性介质和细胞因子等，造成组织进一步损伤，ICAM-1在脑缺血后白细胞介导的脑缺血早期炎症损伤机制中发挥着重要作用［5］。持续局部脑缺血后1 h ICAM-1 mRNA的表达即开始上调，缺血后6 h达高峰，其高峰时间可维持24 h［3］。持续局灶性脑缺血3 h，ICAM-1的蛋白表达水平开始增高，24 h达高峰，持续至120 h［6］。ICAM-1表达上调亦是NF-κB结合到ICAM-1基因启动子上NF-κB目标序列TG-GAAATTCC以后激活表达所致。阻断NF-κB的激活，可抑制ICAM-1的表达和白细胞的跨膜迁移［7］。抗氧化剂通过抗OFR而阻断NF-κB激活，亦可抑制细胞因子诱导的ICAM-1的表达［8］。

    本实验结果表明，脑心康片具有明显的抗脑缺血、抑制ICAM-1表达的作用，且该作用遵循一定的量-效关系。

【】
  　　［1］丁正同，蒋雨平.临床颅脑病学［M］.天津：天津技术出版社，2003:361.

　　［2］Li Y, Chopp M, Powers C, et al. Apoptosis and protein expression after focal cerebral ischemia reperfussion in rats ［J］.Brain Res, 1997, 765（2）: 301 .

　　［3］郝延磊，蒲传强，朱克，等.细胞间粘附分子1和E选择素在局部脑缺血中的作用［J］.中华老年心脑血管病杂志，2000，2（1）：54.

　　［4］Sobel RA, Mitchell ME, Fonder G. Intercellular adhesion molecule (ICAM-1) in cellular immune reactions in the human central nervous system［J］.Am-J-Pathol, 1990,136(6):1309.

　　［5］吴珊，董为伟，董佑忠. 局灶脑缺血再灌流后ICAM-1表达与白细胞浸润［J］.中风与神经疾病杂志，2000，17（1）：5.

　　［6］郝延磊,，蒲传强，张凤英，等. 实验性脑缺血模型脑组织微血管细胞间粘附分子1表达的研究［J］.中华神经科杂志，1998，31（2）：105.

　　［7］Chen CC, Rosenbloom CL, Imuro Y, et al. Ihibition of NF kappaB in activated rat hepatic stallate cells by proteasome inhibitors and an IkappaB super-repressor［J］.Hepatology, 1998, 27(5): 1285.

　　［8］Park,CW, Nico B, Trojano M, et al. High glucose-induced intercellular adhesion molecule (ICAM-1) expression through an osmotic effect in rat mesangial cells is PKC-NF-kappa B-dependent［J］.Diabetologia, 2000, 43(12): 1544.