千里光抗金黄色葡萄球菌作用机制的血清药理学研究
作者：张文平 张文书 王小丽 张瑞其 黄真
【摘要】 目的应用血清药方法研究中药千里光抗金黄色葡萄球菌的作用及其机制。方法从千里光中分离出黄酮类化合物，然后通过给小鼠灌胃制备千里光水浸液的含药血清和黄酮类化合物的含药血清。用扫描电镜观察各含药血清对金黄色葡萄球菌超微结构的影响，用同位素前体参入试验观察各含药血清对金黄色葡萄球菌生物合成的影响。同时设立生理盐水血清作为阴性对照。结果与阴性对照血清相比，两种含药血清作用后的金黄色葡萄球菌，其形态和超微结构均发生明显的变化，菌体塌陷，细菌融合成团，呈现肿胀模糊等变化；其DNA ，RNA 蛋白质和肽聚糖合成也均受到明显的抑制。结论千里光的抗金黄色葡萄球菌作用机制可能是通过抑制细菌的DNA，RNA，蛋白质和肽聚糖的合成有关，其作用的有效成分可能是黄酮类化合物。
【关键词】 千里光；金黄色葡萄球菌；扫描电镜；同位素参入；药物作用； 血清药理学
Abstract：ObjectiveTo explore the antibacterial mechanism of Senecio scandens Buch-Ham(SSB) on Staphylococcus aureus by serum pharmacological method．MethodsFlavonoid compound was isolated from SSB, and then the serum contained water decoct agent of SSB or flavonoid compound were prepared with mice. By scanning electronic microscope (SEM), the effects of drug-containing serum on the ultrastructure of S. aureus were observed. By incorporation experiment of isotope-labeled precursor, the effects of drug containing serum on the biosynthesis of S. aureus were observed as well. Meanwhile, the serum contained normal saline was set as negative control.ResultsCompared with negative control serum, the morphology and ultrastructure of both drug containing serum on S. aureus showed obvious changes :the cell collapsed, melt together, blurred and swollen, ect. In addition, the synthesis of DNA, RNA, protein and peptidoglycan was inhibited.ConclusionThe antibacterial mechanism of SSB on S. aureus may be involved with the inhibition of DNA, RNA, protein and peptidoglycan synthesis, its effective ingredients may be flavonoid compound.
Key words：Senecio scandens Buch-Ham; Staphylococcus aureus; Scanning electronic microscope; Isotope-incorporation; Drug action; Serum pharmacology
千里光Senecio scandens Buch-Ham系菊科千里光属植物，我国南方各省均有分布。该药性凉味苦，具有清热解毒、消炎凉血、明目止痛、去腐生肌之功效，民间广泛用于各种炎症和皮肤病。其化学成分主要有黄酮及其苷类、鞣质、生物碱等。药理实验表明［1，2］千里光及其含药血清对金黄色葡萄球菌等多种细菌均有较强的抗菌作用，黄酮类化合物可能是千里光的主要抗菌有效成分。为了进一步研究千里光的抗菌机制，本研究采用血清药理学方法，以常用的金黄色葡萄球菌为研究对象，结合电镜技术、同位素参入技术等观察了千里光及其黄酮类化合物对受试菌超微结构以及DNA、RNA、蛋白质和肽聚糖等生物合成的影响。现报道如下。
1 材料
1.1 菌株
金黄色葡萄球菌(47-1800Ａ+)购于药品生物制品检定所。
1.2 药物和试剂
千里光购于江西赣南医学院第一附属中药房；同位素标记前体3H-TdR，3H-UdR，3H-亮氨酸，3H-葡糖胺购于中国院上海核技术开发公司。
1.3 动物
BALB/c近交系小鼠，雌雄兼用，体重（20±2）g，由江西省实验动物中心提供。
2 方法
2.1 千里光总黄酮的提取
千里光全草切成小段，以体积分数为95％乙醇回流提取3次，提取液合并后减压浓缩除去乙醇，水溶液以50 mg/ml 碳酸钠处理后以氯仿萃取3次，碱水层以1 mol/ L HCl酸化至pH为2后以醋酸乙酯萃取3次，水洗至中性，醋酸乙酯层浓缩成浸膏即得千里光总黄酮。
2.2 含药血清的制备
2.2.1 千里光水浸液含药血清的制备
取干燥生药加适量水煮沸30 min，过滤药渣再加水煮沸30 min，过滤，合并两次滤液，浓缩得1g/ml千里光水煎剂。将上述水煎剂按40 g/kg给予小鼠灌胃给药，2次/d，共5次，未次给药后2 h，分离血清，制备千里光含药血清［2］，使用前用MH肉汤稀释。
2.2.2 千里光总黄酮含药血清的制备
将千里光总黄酮经NS稀释后按200 mg/ kg给予试验动物灌注，灌注时间及采集方式同“2.2.1”项，制备千里光总黄酮含药血清。
2.2.3 阴性对照血清制备
用生理盐水替代药物灌注动物，灌注时间及采集方式同“2.2.1”项，采集血清作为阴性对照。
2.3 菌液的制备
取储藏菌少许接种于MH琼脂平板，35℃培养24 h使菌种活化。次日取一接种环活化菌接种于1 ml MH肉汤培养基中，35℃培养6～8 h，再取菌液0.1 ml，加入液体培养基至100 ml，稀释1 000倍，调配菌液浓度为5×105CFU/ml。
2.4 含药血清体外抑菌实验
将稀释1 000倍的菌液各取0.1 ml分别加入含药血清各稀释管中，置35℃ 培养箱中培养18～24 h，观察各管的变化。如试管出现混浊，表明有菌生长，含药血清无抑菌作用；如试管澄清，则表明无菌生长，含药血清有抑菌作用，以含药量低而肉眼看不见细菌生长的那一管的含药量为药物对该菌种的最低抑菌浓度(MIC)。实验重复3次。
2.5 同位素前体参入实验［3］
3种受试血清均以1 MIC药物浓度作用于对数生长期的试验菌，均以3H-TdR、3H-UdR、3H-亮氨酸和3H-葡糖胺 (终末浓度为均为0.5 μCi/ml)进行同位素前体参入试验。在无菌的96孔细胞培养板孔中依次加入90.0 μl的药物(空白对照组用生理盐水代替药物)，100.0 μl的菌液及10.0 μl的同位素前体物质，每个药物浓度均设3个平行孔，然后置35℃振荡培养30 min。用多头细胞收集仪收集，将样品吸附在49型玻纤滤纸上，烘干后于液体闪烁计数器(Beckman LS-5000TA)上进行β计数，测出每分脉冲数（cpm），实验重复3次。将试验组和对照组的cpm值进行比较，并按公式参入抑制率。参入抑制率（%）=〔(空白对照组cpm均值-试验组cpm均值)/空白对照组cpm均值〕×100%
2.6 电镜观察［4］
将3种受试血清均以1 MIC药物浓度作用于对数生长期的试验菌，作用8 h后离心收集菌体，将菌体浸入3%戊二醛中，4℃固定至少2 h，丙酮逐级脱水，醋酸异戊脂置换，临界点干燥，金属镀膜置S-570扫描电镜(日本，日立公司)下观察。
3 结果
3.1 含药血清体外抑菌实验
千里光水浸液、千里光总黄酮含药血清以及阴性对照血清对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(滴度)分别为0.2，0.6，1.0。
3.2 同位素前体参入实验
3个含药血清组的cpm值均较空白对照组相应的cpm值明显减少，但千里光水浸液含药血清组和千里光总黄酮含药血清组与空白对照组比较差异均有显著性；千里光水浸液含药血清组和千里光总黄酮含药血清组对4种同位素参入的抑制率均明显高于相应阴性对照血清组 (P<0.01)，而千里光水浸液含药血清组和千里光总黄酮含药血清组对4种同位素的参入抑制率无明显差异(P>0.05)。结果见表1。表1 3组含药血清对同位素前体参入金黄色葡萄球菌的影响（略）
3.3 扫描电镜观察
正常的金黄色葡萄球菌细胞表面光滑、圆润，呈球形，大小和形状一致，细胞与细胞间界限分明，葡萄状排列。经千里光水浸液含药血清和千里光总黄酮含药血清作用后，多数金黄色葡萄球菌的菌体结构被破坏，菌体塌陷，细菌融合成团，呈现肿胀模糊等变化，而经阴性对照血清作用后，菌体结构变化不明显。
4 讨论
血清药方法是指动物经口服给药后采集含药血清进行体外实验的一种方法，它在某种程度上克服了中药制剂本身的理化性质等不确定因素的干扰，不仅能反映中药及其代谢产物的药理作用，而且能反映可能由药物诱导机体内源性成分所产生的作用，更接近药物在体内环境产生的真实过程。该方法现已成为中药体外药效学研究的一种重要手段［5］。
千里光为临床常用的一种抗菌中药，但其抗菌作用机制不明。本研究首次采用血清药理学方法，结合电镜技术和同位素参入技术研究千里光及其有效成分—黄酮类化合物抗金黄色葡萄球菌的作用机制。扫描电镜观察发现经千里光水浸液和千里光总黄酮含药血清作用后，金黄色葡萄球的形态发生了明显变化，而阴性对照组血清作用后金黄色葡萄球的形态变化不明显，说明含药血清对试验菌的细胞壁和细胞膜具有一定破坏作用，而细胞壁和细胞膜一旦被破坏，其细菌细胞就不能维持细胞固有形态，胞内外物质交换受阻，结合于胞膜上的各种酶不能正常发挥作用，导致菌细胞对营养物质吸收降低、生物大分子合成受阻［6］。结合同位素标记参入实验结果也证实了这一点。TdR、UdR、亮氨酸和葡糖胺分别作为DNA、RNA、蛋白质、肽聚糖生物合成的前体物质，以其同位素标记物进行同位素参入实验，可充分反映细菌生物大分子的合成代谢情况。本研究的参入实验结果显示千里光水浸液和千里光总黄酮含药血清对4 种同位素的参入有明显抑制作用，以对3H-UdR的参入抑制率最高，达80%以上，对3H-TdR、3H-亮氨酸和3H-葡糖胺的参入抑制率在60%～75%。上述结果提示千里光的抗菌机制可能是通过抑制金黄色葡萄球菌的DNA、RNA、蛋白质和肽聚糖的合成而表现抑菌和杀菌作用，其作用的有效成分与黄酮类化合物有关，这与报道黄酮类化合物是一类有抗菌作用成分一致［7］，但其确切机制有待进一步研究。
【文献】
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