脑宁康颗粒对脑缺血预适应大鼠HSP70表达影响的实验研究

【摘要】  目的观察中药脑宁康(NNK)颗粒对经脑缺血预适应(IPC)处理后大鼠HSP70表达的影响。方法根据Pulsinelli四管法及Liu法分别制作大鼠IPC及脑缺血再灌注( IR) 模型，应用免疫组化SP法作HSP70染色，比较NNK颗粒对IPC和IR 两种模型大鼠HSP70表达的影响，并以阿斯匹林作对照。结果NNK在两模型中均可使HSP70表达明显增强(P<0.05～0.01),且效应显著高于阿斯匹林(P<0.05)，但两模型之间比较无显著性差异。且NNK能够延缓HSP70表达强度的减弱。结论NNK颗粒通过增强IPC和缺血状态中HSP70表达，扮演了强化IPC及药物预适应角色，旨在增加脑神经细胞对缺血、缺氧的耐受力，并通过对HSP70的干扰，获得稳定神经细胞结构，维护其正常功能的药理效应。

【关键词】  脑宁康颗粒； 缺血预适应； 脑； HSP70

    Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Naoningkang particle on the expression of the 70KDa heat shock protein (HSP70) following the rats'ischemic precondition .MethodsThe rats' IPC and ischemic reperfusion ( IR ) models were made by methods of  Pulsinelli four tubes and Liu respectively. The expression of HSP70 in two rat models including IPC and IR were compared by NNK particle applying SP immunohistochemistry method. ResultsNNK particle could increase the HSP70 expression of IPC and in the state of ischemia and play the role on stronging ischemic precondition of IPC and medicine. The effect of NNK particle suggests increasing the tolerance of central nerve cells facing to ischemia and  hypoxia. ConclusionNNK particle also can stabilize the structure of neuron through interfere with HSP70 expression , and then it demonstrate the pharmacologic effect of keeping the neuron normal functions.

    Key words：NNK particle;   Ischemic preconditioning;   Brain;   HSP70

    近年来，脑缺血预适应( ischemic preconditioning, IPC)过程中产生的机体重要保护因子热休克蛋白（Heat shock protein, HSP）已引起广泛关注。对整体和离体经应激作用后的细胞或组织的研究表明［1］，当细胞受到损伤时，均伴随HSP含量增加。因而，普遍认为HSP的功能主要是在于稳定细胞的结构，从而维护细胞的正常生理功能。在脑缺血损伤领域的研究显示，HSP具有保护脑细胞，增加脑细胞对缺氧的耐受性，明显降低神经元对谷氨酸毒性作用的敏感性［2］，从而抵抗神经元进一步致死性损伤的作用。本研究拟观察HSP70在IPC和脑缺血再灌注( ischemic reperfusion, IR ) 中的表达及脑宁康(NNK)对其的影响。 现报道如下。

    1  材料与仪器

    1.1  仪器多功能显微镜(OLYMPUS-269865,JAPAN)，电镜（JEM-1200EX,JAPAN），医用低温冷冻冰箱（SANYO,JAPAN），蠕动泵（LDB-M）。

    1.2  试剂与药品鼠抗HSP70单克隆抗体（Neomarker Corporation, USA），链卵白素－生物素结合辣根过氧化酶，1∶300zymed,USA)，染色试剂盒（Labvision Corporation, USA）。NNK颗粒由山东中医药大学附属制剂厂生产，生药含量为5 g/g； 肠溶阿斯匹林(ASP)为沈阳克达药厂生产，批号970208。

    1.3  动物雄性Wistar大鼠48只，平均体质量(300±30) g， 由山东医科大学实验动物中心提供。

    2  方法

    2.1  模型制备与取材

    2.2  分组Wistar鼠48只，用随机数字表法将动物随机分为模型组(MODEL)、假手术组(FO)、ASP组和NNK组, 每组均按IPC方法和IR方法制模, 共8组, 每组6只。

    2.3  模型制备

    2.3.1   IPC模型制备IPC模型根据Pulsinelli四管法及Liu法［3］制备。戊巴比妥钠50 mg/kg经腹腔注射麻醉，颈部正中线纵行切口，分离暴露第 1 颈椎，寻找双侧翼小孔，电灼封闭双侧椎动脉。翻转体位，颈部纵行切口，分离暴露双侧颈总动脉约2cm ，4号手术线牵引。头部正中切口，顶部钻孔，埋藏微电极，齿科水泥固定。动脉夹夹闭两侧颈总动脉，造成全脑缺血，微电极连接八道生理仪观察脑电图, 验证缺血效应。缺血3 min后, 松开动脉夹，恢复供血，缝合皮肤，按成人剂量7倍分别给予NNK组及ASP组相应药物。24 h后， 再次夹闭两侧颈总动脉3 min。假手术组依上法操作, 但不封闭及夹闭椎动脉、颈总动脉。各组饲以标准合成饲料, 饮水。

    2.3.2  IR模型制备IR模型制备方法同上，但不进行两次3 min缺血预适应处理，服药时间与IPC模型同步。在IPC模型第2次短暂缺血后72 h，除假手术组外的其余6组均再次夹闭颈总动脉10 min，并于缺血再灌注24 h后取血备测。

    2.3.3  取材分别于IR后24，72 h，戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉大鼠，开胸暴露心脏，经升主动脉插管后，通过LDG-M型蠕动泵，快速灌入肝素化生理盐水（2万u/100ml）100 ml，随后用4％多聚甲醛磷酸缓冲液4℃，pH 7.4，200 ml，灌注1 h，立即冰台取脑，分离皮层组织块，动存于-70℃冰箱，用于检测HSP70表达。另一部分组织块用0.1 m的磷酸缓冲液配制的1％饿酸溶液（pH 7.4）固定2 h，PBS充分洗涤，1％饿酸溶液后固定，4℃，递增浓度的酒精脱水，EPON812包埋液浸透，包埋。切片用醋酸钠和枸橼酸铅染色，半薄切片定位，超薄切片，TEM-1200EX透射电镜观察。

    2.4  HSP70检测方法  根据匡式法，组织标本冰冻切片上行30 μm连续冠状切片。室温下，2％TritionX-100液中孵育40 min，切片浸入鼠抗HSP70单克隆抗体孵育48 h，4℃。抗体用1％血清白蛋白磷酸缓冲液配制，经PBS洗涤10 min,浸入生物素结合兔抗鼠IgG，室温下孵育2 h，再经PBS洗涤，切片浸入链卵白素--生物素结合辣根过氧化酶孵育2 h(室温)。PBS充分洗涤，加1～2滴DAB色素于C2H12O6梯度脱水，透明，D-P-X封片备测。

    2.5  统计方法 采用SPSS12.0统计分析软件，实验数据用±s表示，显著性检验用配对t检验或方差分析，P<0.05为有统计学显著性。

    3  结果

    NNK对HSP70表达的影响见表1。由表1可见：①皮层结构中，再灌注24 h、假手术组未见明显HSP70阳性信号；IPC模型组及再灌注模型组均可见HSP70阳性信号，但前者阳性细胞数量及染色深度明显强于后者（P＜0.05），提示经IPC处理后，HSP70表达明显增加。②以NNK及阿斯匹林干扰后发现，NNK在两模型组中均可使HSP70表达明显增强（P＜0.05～0.01），且效应显著高于阿斯匹林（P＜0.05），提示NNK能积极干扰HSP70诱导程序。③模型间比较，NNK对HSP70的影响虽以IPC模型稍强，但无明显差异（P﹥0.05）。提示NNK既可能在IPC过程中有诱导HSP70表达效应，亦可能在缺血再灌注损伤中扮演药物预适应角色。④从不同时期HSP70表达强度分析中发现与24h时相比较，72 h时相其表达强度明显减弱（P＜0.05），但NNK可以延缓这一过程（P＜0.05）。提示NNK颗粒在诱导和调控HSP70表达方面均有药理效应。表1  NNK颗粒对模型HSP70表达的影响

    4  讨论

    热休克现象是Ritossa在观察果蝇幼虫唾液腺细胞染色体在过热过程中形态变化时首先发现的。后来，Tissieres等发现，染色体的膨突与细胞中的蛋白质合成有关，故称其为热休克蛋白（Heat Shock protein, HSP）。生物体受外界环境的应激作用诱导产生的HSP组分较为复杂，不仅能产生分子量相差很大的HSP，也能产生几个在分子量上十分接近的HSP。哺乳动物以HSP70家族为主。热应激、缺血/缺氧、氧自由基等均是重要的诱导因素。近年来， HSP在缺血预适应（IPC）过程中的脑保护作用已经被广泛认可，之前大多认为其保护大脑的机制是由于HSP70的伴侣作用。而最新报道认为，HSP70也能够调节炎症反应，从而显示出其脑保护的作用。

    本研究结果表明，分别经IPC处理及缺血6 min再灌注24 h后，两模型组Wistar鼠大脑皮层结构中均有HSP70表达，而以前者为强。NNK颗粒干扰后，两组HSP70表达明显增强，提示NNK既有可能诱导HSP70表达效应，同时也可能在缺血再灌注损伤中发挥药物预适应作用。不同时相HSP70表达强度分析显示，缺血72 h HSP70表达强度明显弱于24h时相，而NNK可使72 h时相HSP70减弱幅度变小，提示该药在调控HSP70表达方面有药理效应。由于NNK干扰了IPC过程中HSP70的表达，使得在缺血状态中HSP70对皮层神经细胞的保护作用增强，因而获得了较优的效应。综上所述，NNK不论在IPC状态中抑制或缺血再灌注状态中均能使HSP70表达增强，扮演了强化IPC及药物预适应角色，旨在增加脑神经细胞对缺血、缺氧的耐受力，并通过对HSP70的干扰，获得稳定神经细胞结构，维护其正常功能的药理效应。

【】
  ［1］ 任惠民,周兆年.稳定细胞结构的分子基础:热休克蛋白［J］.生理进展，1994,25（1）:11.

［2］ Rodorf G, Koroshetz WJ, Bonveutre JV. Heat shock Protests cultured neurous from glutamate toxicity［J］. Neuron, 1991,7:1043.

［3］ L iu Y. Protection of rat hippocampus against ischemic neuronal damage by pretreatment with suble that ischemia［J］. Brain Res,1992, 586 (1) : 121.