丹酚酸B体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究
作者：徐秀梅，郭茂娟 赵旭 范英昌
【摘要】 目的 观察丹酚酸B(SalB)干预体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制。方法分离培养及鉴定大鼠MSCs，对其进行分组诱导:SalB组(终浓度为250 μg/L)、5-氮胞苷组(终浓度为10 μmol/L)、SalB联合5-aza组(终浓度分别为250 μg/L与10 μmol/L)，诱导24 h后继续培养4周，观察其形态学变化，免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T (cTnT)的表达, 实时荧光定量RT-PCR法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a-actin mRNA的表达。结果诱导后的MSCs体积增大，增殖减慢，并出现肌管样结构；免疫细胞化学结果显示诱导后的MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT，与5-aza组相比，SalB组cTnT表达较低，SalB联合5-aza组cTnT表达升高；实时荧光定量RT-PCR结果显示各组均表达心肌分化早期基因，SalB联合5-aza组诱导后的MSCs的心肌早期分化基因表达明显高于其他两组。结论SalB可在体外诱导大鼠MSCs定向分化为心肌样细胞，其与5-aza联合诱导可明显提高MSCs向心肌细胞分化的能力。
【关键词】 丹酚酸B； 骨髓间充质干细胞； 体外诱导； 免疫细胞化学； 实时荧光定量RT-PCR
骨髓间充质干细胞(MSCs)系自体来源,取材容易,扩增能力强,是一种体内外均有极强的分化潜能的干细胞［1］。1995年，Wakitanis等［2］发现体外分离培养的大鼠MSCs体外可被5-aza诱导分化为心肌样细胞。但5-aza作为抗肿瘤药物具有一定的毒副作用,故寻找安全、有效的诱导剂应是目前的重要课题。我们前期的研究结果表明SalB可以减小心肌梗塞的面积［3］，并能有效地促进梗塞灶内成纤维细胞的增生，加速心脏的修复过程。那么，它对有心肌分化潜能的MSCs起什么作用呢？为进一步研究其机制，我们进行了中药单体丹酚酸B(SalB)体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的研究。现将研究结果报道如下。
1 器材
1.1 动物
（200±20）g体重的Wistar雄性大鼠，购于医学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk2005-0001。
1.2 试剂与仪器
L-DMEM培养液、1∶250胰蛋白酶、EDTA、双抗，Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,Hyclone公司；D-Hanks缓冲液； percoll淋巴细胞分离液，Pharmacia公司；CD44兔多克隆抗体〔Rabbit Anti-CD44(HCAM)〕、CD34兔多克隆抗体（Rabbit Anti-CD34）、即用型SABC免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒、PBS缓冲液，武汉博士德生物工程有限公司；小鼠抗大鼠单克隆抗体Troponin T, Cardiac Isoform Ab-3(Clone CT-3)，美国Lab vision公司；即用型SP免疫组化染色试剂盒(cat.no.MSP859143)，天津灏洋生物制品科技有限责任公司；TaqMan Reverse Transcription Reagents、SYBR Green PCR Master Mix reagent kits试剂盒(Applied Biosystems)、Trizol总RNA提取试剂，天津润泰科技有限公司；5％CO2恒温培养箱（model TC2323 CO2 incubator）；倒置相差显微镜（XD-101 98010）；SW-CJ-2FD型单人双面净化工作台；离心机（LDZ5-2）；UV-530紫外分光光度计(上海生物仪器厂)；PCR仪(美国HYBAID)；ABI7300实时定量PCR仪。
1.3 药品
5-aza，Sigma公司；丹酚酸B，天津天士力制药股份有限公司。
2 方法
2.1 MSCs的分离培养
将大鼠脱颈处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，适量D-Hank's液冲洗骨髓，100目筛网过滤，将密度为1.073g/ml的Percoll预先置于试管的底部,然后按照1∶1的比例沿管壁缓慢滴加骨髓悬液，离心（1 800 r/min,20 min），收获位于界面层灰白色的单个核细胞,用L-DMEM离心洗涤2次（800 r/min,5 min）后接种于完全培养液（含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素的L-DMEM培养液），置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中继续培养，24 h后首次换液，以后每3 d更换1次培养液，2周后细胞长满瓶底。
2.2 MSCs的传代及纯化
待原代MSCs长满瓶底时，用1∶1配比的0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA对细胞进行消化2～3 min，以完全培养液中止消化并反复吹打贴壁细胞，制成单细胞悬液,按1∶3进行传代培养，直至贴壁细胞彼此融合铺满瓶底时,重复上述操作,反复传至第9代。
2.3 MSCs的鉴定
选用生长状况良好的第9代 MSCs，用免疫细胞化学方法检测细胞表面抗原CD44和CD34。将第9代的大鼠MSCs培养于6孔板，孔板内预置无菌盖玻片，周后，细胞80%长满瓶底，用95%乙醇（加少量冰醋酸）固定15 min，PBS彻底清洗。滴加5%BSA封闭液，室温孵育20 min，甩去多余液体，不洗。滴加以1∶100浓度稀释的一抗（兔IgG）4℃过夜。余按SABC免疫组化试剂盒操作说明进行。苏木素轻度复染、脱水、透明、封片。
2.4 MSCs的诱导分化
将第9代MSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板中，培养2 d，将完全培养液换为无血清培养液，24h后进行分组诱导：SalB组(终浓度为250 μg/L)、5-aza组(终浓度为10 μmol/L)、SalB联合5-aza组(终浓度分别为250 μg/L，10 μmol/L)，并设空白对照组,仅用基本培养液(L-DMEM)诱导。诱导剂作用24 h后，更换完全培养液继续培养，每3 d换液1次，共4周。
2.5 免疫细胞化学鉴定心肌特异性蛋白cTnT
取诱导后4周的细胞，用95％乙醇（加少量冰醋酸）固定15 min，PBS彻底清洗。用羊血清封闭，滴加cTnT(1∶50)，阴性对照用PBS代替一抗cTnT，4℃冰箱过夜。其余步骤按超敏S-P试剂盒操作程序进行，最后苏木素复染，梯度酒精脱水，中性树脂封固。显微镜下观察，胞质中有棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞。每组选取染色较好的8张玻片，在显微镜下每张玻片取5个视野，由数码摄像机摄入，用Image Pro Plus6.0图像分析软件对结果进行分析。
2.6 实时荧光定量RT-PCR检测
心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a-actin mRNA的表达 取诱导后4周的细胞，按以下步骤进行操作：(1)RNA提取与cDNA的合成:取诱导后4周的细胞，采用Trizol一步法提取总RNA，按照试剂盒说明进行反转录，反转录条件为：25℃10，48℃30，95℃5 min。(2)实时PCR法检测心肌早期基因NKX2.5，GATA-4，Desmin和a-actin的相对表达量：从NCBI基因库查找、验证后，确定各目的基因和管家基因的引物序列，由北京赛百胜基因有限公司合成，引物序列见表1。根据试剂盒说明进行扩增，扩增条件为95℃，10 min；95℃，15sec→60℃，1 min，40循环。（3）所得CT值经转换后以2-ΔΔCT相对定量法获得每个样本各目的基因相对表达量的数值。表1 各目的基因及内参照基因引物序列（略）
2.7 统计学方法
结果用±s表示。应用SPSS 11.5统计软件采用单因素方差分析进行组间比较，以P＜0.05为具有统计差异。
3 结果
3.1 MSCs的形态特征
刚分离接种的MSCs镜下呈圆形，大小不一，数目较多，24 h内贴壁完成，但仍有较多的圆形细胞悬浮于培养液中，2～3 d后细胞呈梭形，体积较悬浮的圆形细胞大，大小较均一，核浆分界清楚，折光性强。8～9 d形成多个克隆，细胞排列有一定方向性，多成“漩涡状”或“网状”生长。传代细胞保持原代细胞的形态特征，24 h内完全贴壁，呈梭形，增殖迅速，5～7 d即铺满培养瓶底部，发生接触抑制不再生长，需及时传代。在整个培养过程中，通过换液可去除不贴壁的红细胞，通过传代可去除贴壁比较牢固的巨噬细胞、单核细胞等，随着传代，细胞得到纯化。
3.2 MSCs表面抗原的鉴定
镜下可见阳性细胞胞浆内含棕黄色、颗粒状物质。永生化的MSCs免疫组化染色CD44表达阳性，不表达CD34。
3.3 MSCs诱导后的形态变化
阴性对照组细胞在诱导1周后基本长满培养瓶底，而各诱导组细胞死亡较多。2周后，阴性对照组的细胞因生长抑制开始死亡，细胞重叠生长，状态不佳；诱导组细胞仍有少量死亡，但部分细胞体积开始变大，形态呈梭形、长方形、不规则形；3周后，阴性对照组的细胞大片死亡，镜下形态不清；各诱导组细胞呈梭形、长方形的细胞数量相对增多，细胞增殖能力减弱，数量较诱导前减少，个别胞浆中可见明显颗粒状物质，部分视野可见肌管样结构；第4周，阴性对照组的细胞形态模糊；各诱导组细胞形态均一，细胞间发生融合，排列具有方向性，更多视野可以观察到明显的肌管样结构，以SalB联合5-aza组最为明显。
3.4 诱导后MSCs的免疫细胞化学鉴定
未诱导的MSCs空白对照组未发现cTnT阳性细胞, SalB，5-aza，SalB联合5-aza诱导的各组中cTnT免疫细胞化学染色均可见阳性细胞,与5-aza相比，SalB联合5-aza组的cTnT表达明显增加，阳性表达率为28.21%，单纯SalB组的阳性表达率较低。结果见表2。
3.5 实时荧光定量RT-PCR检测
心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a-actin mRNA的表达结果显示，各组均表达心肌分化早期基因，SalB联合5-aza组诱导后的MSCs心肌早期分化基因表达明显高于其他两组（见表3）。诱导后各基因的溶解曲线和扩增曲线见图1～10。表2 各诱导组MSCs的cTnT阳性表达率比较(略) 表3 3组NKx2.5，GATA-4，Desmin，a-actin mRNA相对表达量的比较(略)
4 讨论
随着MSCs分离、培养和纯化技术的不断和成熟，越来越多的研究者关注于诱导其定向分化为所需的细胞，其中处于心脏细胞与组织再生工程领域的人们正热衷于诱导其向心肌细胞分化的研究。Liu等［4］实验表明，原代和第1代的MSCs用不同浓度的5－aza单次或多次诱导后均未出现心肌样细胞，证明未永生化的MSCs在体外是不能分化为心肌细胞的。骨髓间充质干细胞经连续传代4个月以后得到永生型细胞(immortalized cells),即纯化的间质干细胞［5］。未分化的永生化MSCs对诱导成功很关键。因此，本课题组选用了第9代的MSCs。
5-aza是研究最多的干细胞分化体外诱导剂，也是目前较公认的可以诱导MSCs分化为心肌细胞的药物。5－aza是一种胞苷类似物，能引起DNA中某些胞嘧啶去甲基化，而DNA的甲基化与基因表达密切相关。所谓甲基化是指细胞通过一个甲基集团与CPG二核苷酸的胞嘧啶环的5'-末端共价结合以修复基因，一般近70%的CPG残基被甲基化，甲基化的结果是这些基因不被表达，而那些非甲基化的基因表达。在胚胎发育早期，特异性基因选择性的去甲基化使细胞向不同方向分化［6］。我们的实验验证了5-aza可以诱导永生化的MSCs向心肌细胞分化。
肌钙蛋白（Tn）包含了3种成分：肌钙蛋白C(TnC)、肌钙蛋白I(TnI)和肌钙蛋白T(TnT)。他们在横纹肌和心肌的收缩调节中起重要作用。肌钙蛋白T(cTnT)是肌钙蛋白的原肌球蛋白的粘合亚型，与肌动球蛋白上的决定ATP酶活性的Ca2+的敏感性有关。存在于快慢骨骼肌及心肌亚型中。cTnT在心肌与骨骼肌上的氨基酸序列是不同的,两者在结构上和免疫方面也有很大的区别,其抗血清的交叉反应率只有1%～2%,不易受骨骼肌的影响，是鉴定心肌细胞的比较特异性的蛋白。因此，本实验选其作为鉴定MSCs向心肌细胞分化的重要检测指标。结果显示除阴性对照组外，各组均表达cTnT。为探讨确切机制我们从基因水平做了进一步的实验。研究认为，分化信号提供给MSCs后，引起调控MSCs分化的关键基因表达改变，决定了干细胞的定向分化方向［7，8］。目前已发现的与心脏发育相关的基因有很多，我们选择的是目前比较公认和研究较多的心肌早期分化基因Nkx2.5、GATA-4、Desmin和a-actin。NKX2.5、GATA-4是对心脏早期发育具有至关重要作用的转录因子［9，10］。Nkx2.5基因在心脏中特异表达，在胚胎、胎儿心肌细胞中保持一定的表达水平，是心脏前体细胞分化的最早期标志之一。GATA-4作为GATA转录因子家族成员，具有两个锌指结构域，在心脏中特异性表达，最初表达于原始心肌中层，然后在血管和心脏内膜及肌层中表达，它除了直接参与调节心肌细胞结构基因和相关调控基因的表达外，还可与几种心肌基因调控区的DNA结合，参与心肌细胞的分化过程。NKX2.5、GATA-4在心肌细胞发育的早期即出现表达，两者单独或协同作用可促进正常心肌细胞的特化、分化和成熟。Desmin和α-actin都是细胞的骨架蛋白。Desmin作为心肌细胞分化的一种早期的标志已经得到公认，是最早表达于未分化的肌母细胞中的肌源性蛋白［11］，在肌源性细胞的发育、成熟过程中起重要作用，能够维持肌纤维形态、连接细胞核与细胞膜而使肌小节之间发生信号联系。α-actin为肌动蛋白的一种亚型，是骨骼肌和心肌的特异性具有收缩功能的细胞骨架蛋白，为胎儿或新生儿心室肌的主要成分。因此Desmin和α-actin的表达阳性说明MSCs发生了肌源性分化。心肌细胞的发育是一个连续的过程，其中涉及多种基因的参与和调控，这些基因的表达及它们之间的相互作用在心肌发育过程中至关重要。据报道［12］，SalB能改善心肌梗塞大鼠的心脏功能,并能使心肌基因表达谱发生改变。本研究从体外初步探讨了SalB诱导MSCs分化为心肌样细胞的机理，从实验结果我们认为SalB诱导MSCs向心肌细胞分化的可能机制一方面是由于SalB作用于MSCs后分泌某些有利于心肌细胞生长的因子，从而影响了其向心肌细胞分化的相关基因及蛋白的表达；另一方面可能是由于其上调了心肌分化相关基因的表达。但是SalB诱导MSCs的心肌分化率较低，若要用于临床，尚需更进一步的研究与实践。同时，我们的研究结果显示SalB联合5-aza可以提高心肌分化率，那么，其能否减少5-aza作用所带来的负面影响呢？这仍需要进一步的实验研究。
【】
［1］Whitelaw ML,McGuine J.Heat shock protein hsp90 regulates dioxin receptor functionin vivo［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(10): 4437.
［2］Wakitani S,Sanito T,Caplan A I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine［J］.Muscle Nerve.1995,18:417.
［3］范英昌，赵桂峰，张文治. 丹酚酸B对大鼠心肌梗塞过程中病理形态学的影响［J］.天津中医学院学报,2004,23（1）：12.
［4］Liu Y, Song J, Liu W. et al. Growth and differentiation of rat bone marrow stromal cells:does 5-azacutidine trigger their cardiomyogenic differentiation［J］.Cardiovasc Res.2003,58：460.
［5］Makino S, Fukuda K, Miyoshi S,et al. Cardiomyocytes can be gene rated from marrow stromal cells in vitro［J］.J Clinical Invest,1999, 103：687.
［6］Bird A.The essentials of DNA methylation. Cell.1992 ,70：5.
［7］Spradling A, Drummond-Barbosa D, Kai T. Stem cells find their niche［J］.Nature, 2001, 414(6859): 98-104.
［8］Watt FM, Hogan BL. Out of Eden: stem cells and their niches. Science, 2000,287(5457)：1427.
［9］Ventura C, Maioli M. Opioid peptide gene expression primes cardiogensis in embryonal pluripotent pluripotent stem cells［J］.Cire Res, 2000, 87：189.
［10］Nemer G, Nemer M. Regulation of heart development and function through combinatorial interactions of transcription factors［J］.Ann Med, 2001, 33(9)：604.
［11］Lawsom-Smith MJ, McGeachie JK. The identificaion of myogenic cells in skeletal muscle, with emmphasis on the use of tritiated thymidine autoradiography and desmin antibodies［J］.J Anat, 1998, 192(2)：161.
［12］刘杰, 高秀梅,王 怡.丹酚酸B对急性心肌缺血大鼠血流动力学的影响及作用分子机制研究［J］.中草药，2006，37（3）：409.
