HG颗粒对四氯化碳复合法致肝纤维化大鼠肝胶原纤维及羟脯氨酸含量的影响
作者：毕红征，薛敬礼，黄国钧，王纯耀
【摘要】 目的研究HG颗粒对（四氯化碳）CCl4 致肝纤维化大鼠肝脏胶原纤维及羟脯氨酸(Hyb)含量的影响。方法70只SD大鼠，除空白对照组10只外，其余各组大鼠皮下注射CCl4，同时予高脂饲料和20%乙醇喂养6周建立肝纤维化大鼠模型，存活大鼠随机分为5组，加上空白对照组，动物共计6组，分别给予药物或蒸馏水。空白对照组:蒸馏水0.1 ml/kg；模型对照组:蒸馏水0.1 ml/kg；HG颗粒高，中，低3种剂量组:6，3，1.5 g生药/kg；复方鳖甲软肝片组：1 g/kg，灌胃，1次/d，连续4周。观察大鼠肝胶原纤维及Hyb含量的变化。结果模型大鼠肝胶原纤维及Hyb含量均明显增高。HG颗粒3剂量组治疗后均能降低大鼠肝胶原纤维组织及Hyb含量，复方鳖甲软肝片亦可降低胶原纤维及Hyb含量。结论 HG颗粒对CCl4复合法致肝纤维化模型大鼠具有显著的治疗作用。
【关键词】 HG颗粒；胶原纤维；羟脯氨酸
Abstract：ObjectiveTo explore the effects of HG Granule on collagen and Hyp in the liver of HF model rats. MethodsSeventy SD rats excluding ten rats in blank control group were injected carbon tetrar-chloride（CCl4） hypodermicly,at the same, fed with the high fat and 20% ethyl alcohol for six weeks to established HF model rats. Existing rats were divided into five groups randomly acconding to sex and weight. All rats were given drugs or distilled water.Blank control group: distilled water 0.1ml/kg；model control group: distilled water 0.1 ml/kg；HG granule to high,middle,low groups：6，3，1.5 g crude drug/kg；FFgBJRGP group：1 g/kg. Through tube feeding once a day for four weeks.The contents of collagen and Hyp in the liver were assayed.Results Contents of collagen and Hyp in the model rats were significantly higher than that in blank group. After treatment of HG granule with high，middle，low dosages，collagen fibrosis and Hyp in rats decreased respectivly，FFBJRGP also decreased collagen fibrosis and Hyp in the liver. ConclusionHG granule has therapeutic action on HF model rats induced by carbon tetrar-chloride compounded with other factors.
Key words:HG granule；Collagen Fibrosis；Hyp
肝纤维化（hepatic fibrosis）是各种慢性肝病进展中由于肝内纤维生成与降解失衡，导致过多的胶原在肝内沉积所致，常伴有炎症并可为肝硬化［1］。肝纤维化是慢性肝病重要的病理特征，也是肝硬化发生的前奏和必经中间环节，其中25%～40%最终发展为肝硬化乃至肝癌［2］。阻断肝纤维化的发生和发展，对防治肝硬化和慢性肝病具有重要意义［3］。HG颗粒是由丹参、桃仁等中药组成的复方制剂，临床治疗肝纤维化有良好的疗效。本试验旨在观察HG颗粒对CCl4加高脂饲料、乙醇造成的肝纤维化大鼠肝脏纤维化指标的影响，为其临床用药提供试验依据。
1 器材与方法
1.1 药物、动物、仪器及试剂
HG颗粒10 g生药/袋, 成都中医药大学中药制剂学教研室提供，批号041014。复方鳖甲软肝片0.5g/片，内蒙古福瑞中蒙药科技有限公司出品，批号20030710。以上两药在临用时以蒸馏水配成相应浓度的溶液备用。
健康SD大鼠70只，普通级，雌雄各半，190～230 g，成都中医药大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：川实动管质第11号。
7530紫外可见分光光度计，Agilent公司产品。TG16-WS高速离心机，湖南赛特仪器厂产品。HANGPING FA1104天平，上海良平仪器仪表有限公司产品。MIAS-2000型图像分析系统，四川大学图形图像研究所产品。BX61型光学显微镜，日本OLYMPUS公司产品。
CCl4分析纯，购自徐州试剂厂，批号0210201。橄榄油溶液，购自北京芳草医药公司，批号030303。羟脯氨酸（Hyp），购自上海伯奥生物科技公司，批号20040417。
1.2 模型建立及分组
70只SD大鼠，除空白对照组10只外，其余60只第1周（首次）用纯CCl4 5 ml/kg对大鼠背部皮下注射，第2～6周用40%CCl4-橄榄油3 ml/kg 对大鼠背部皮下注射，2次/周。同时第1～6周内，以高脂玉米粉饲料（79.5%玉米粉、20%猪油、0.5%胆固醇）饲喂大鼠，并以20%乙醇作为大鼠的唯一饮水。连续6周，复制大鼠肝纤维化模型［4～5］。将复制CCl4肝纤维化模型至第6周而存活的大鼠，按性别及体重随机分成5组，每组10只，加上空白对照组，共计6组。分别为：空白对照组：蒸馏水0.1 ml/kg；模型对照组：蒸馏水0.1 ml/kg； HG颗粒高，中，低3种剂量组：6，3，1.5 g生药/kg；复方鳖甲软肝片组1 g/kg，1次/d，连续4周。
治疗结束后处死动物，在大鼠左叶肝脏固定部位剖取肝组织块，浸泡于4%甲醛中固定48 h以后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，常规切片4 μm，Masson染色。首先在低倍（100×）视野下观察全片，胶原纤维染色呈蓝色。然后选择切片上蓝色胶原纤维最丰富区域10个视野，在中倍视野（200×）下采用MIAS-2000病理图象分析系统定量检测肝胶原纤维化的面积、周长、平均光密度、积分光密度和平均灰度。治疗结束后处死动物在大鼠左叶肝脏固定部位剖取肝组织1 g，测定Hyp含量。
1.3 统计学处理
所有数据均采用统计软件SPSS13.0进行统计学处理，多组间比较用单因素方差分析，多组间比两两比较用q检验（SNK法）。各项指标均以均数±标准差(±s)表示。
2 结果
2.1 HG颗粒对CCl4复合法致肝纤维化大鼠肝脏胶原纤维含量的影响
由表1可知，造模6周后，模型组大鼠肝胶原纤维组织的面积、周长、平均光密度、积分光密度、平均灰度较空白组分别增加413.90%（P<0.01），118.36%（P<0.01），86.58（P<0.01），418.58%（P<0.01），156.96%（P<0.01）。HG颗粒4周后，3种剂量能使大鼠肝胶原纤维面积缩小71.60%，65.60%，53.25%（P均<0.01）；使周长缩短28.78%（P<0.01），28.21%（P<0.01），9.73%（P>0.05）；使平均光密度降低28.47%，23.26%，30.39%（P均<0.01）；使积分光密度降低66.16%，59.68%，50.43%（P均<0.01）；使平均灰度降低58.24%（P<0.01），44.22%（P<0.01），17.29%（P>0.05）。复方鳖甲软肝片对大鼠肝纤维化亦有显著治疗作用。表1 HG颗粒对CCl4复合法致肝纤维化大鼠肝脏胶原纤维含量的影响（略）
2.2 HG颗粒对CCl4复合法致肝纤维化大鼠肝组织Hyp含量的影响
由表2可知，造模6周后，模型组大鼠肝Hyp含量比空白组大鼠显著增高，增高44.94%（P<0.01）。经HG颗粒高，中，低3种剂量治疗4周后，对升高的肝组织Hyp含量具有不同程度的降低作用，分别比模型组降低13.67%（P<0.05），19.79%（P<0.01）和10.63%（P>0.05）。复方鳖甲软肝片亦能使大鼠肝Hyp含量降低20.99%（P<0.01）。表2 HG颗粒对CCl4复合法致肝纤维化大鼠肝组织Hyp含量的影响（略）
3 讨论
中医药治疗肝纤维化有悠久的，肝纤维化属中医“胁痛”范畴，中药复方治疗是祖国医学的特点所在，复方的疗效往往优于单味药物。中医中药治疗肝纤维化，具有疗效显著，费用相对低廉，且毒副反应少的特点［6］。肝纤维化的病机关键是热毒淤结，肝脾损伤［7］。
HG颗粒由丹参、桃仁、白芍、柴胡、黄芪、汉防己、冬虫夏草药物组成，丹参、桃仁活血养血，化淤止痛为君，白芍、柴胡柔肝养肝为臣，佐以黄芪益气健脾，冬虫夏草益精补肾，汉防己行水消肿,清利湿热。全方配伍，共奏活血化淤，软坚散结，补养正气之效。与复方鳖甲软肝片相比，HG颗粒减少了化积通络的药物如鳖甲、莪术等，减少了补益药物紫河车、黄芪等，增加了柔肝养肝止痛的白芍、柴胡。如此组方，是因为肝纤维化属于肝硬化起始阶段，正气不甚虚弱，淤结不甚顽固。故药味有别于治疗肝硬化疗效良好的复方鳖甲软肝片。
药物性肝纤维化是指具有肝毒性的药物，进入体内使肝细胞变性，坏死，从而启动肝纤维化的发生。CCl4诱导的大鼠肝纤维化动物模型在形态学、病理生的某些方面与人的肝纤维化十分相似。但单一因素注射CCl4造模虽然操作简单，但制备的周期长，成模比例低，且死亡率较高。因此，我们采用CCl4、高脂食物、酒精复合因素制作肝纤维化模型，此种模型可靠且复制时间短，形成率高，死亡率低，肝纤维化进展稳定，适合于以引起肝细胞损伤为始动机制的肝纤维化发生发展过程的动态研究［8］。本试验结果表明：HG颗粒可以显著降低CCl4复合法致肝纤维化模型大鼠肝脏胶原纤维及Hyp含量。肝脏胶原纤维是反映肝纤维化的客观明确指标，在肝纤维化的诊断中有着根本的意义，而Hyp是衡量机体胶原组织代谢的重要指标，测量Hyp含量可以较好的反映肝组织胶原的合成情况。我们通过对肝脏胶原纤维及Hyp含量的测定，充分表明HG颗粒具有良好的抗肝纤维化作用。
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