白英提取液对人肺癌A549细胞凋亡及Fas/FasL基因表达的影响

                作者：涂硕，韦星，赵小曼，余乐涵，万福生

【摘要】  　　目的　探讨白英提取液(STE)对人肺癌A549细胞凋亡及fas/fasL基因表达的影响。方法体外培养肺癌A549细胞，以0（正常对照组），10，20和40 mg/ml STE处理A549细胞48 h，并以25 mg/L顺铂（DDP）作为阳性对照。采用MTT法检测细胞增殖抑制率，TUNEL法检测凋亡率，半定量RT-PCR检测fas和fasL mRNA表达。结果与正常对照组比较，STE各浓度组细胞增殖抑制率显著上升（P﹤0.01），细胞凋亡率明显升高（P﹤0.01），基因fas mRNA表达显著上升（P<0.05或P<0.01），而fasL mRNA表达明显下降（P<0.05或P<0.01）。结论STE通过上调fas基因和下调fasL基因表达，诱导细胞凋亡，从而抑制A549细胞增殖。

【关键词】  白英；A549细胞；细胞凋亡；Fas/FasL基因
　　
　　Abstract：ObjectiveTo explore the effects of Solanum lyratum Thunb. Extract (STE) on induction of apoptosis and the expression of fas and fasL genes in A549 cells. MethodsLung cancer A549 cells were treated with 0（control group），10，20 and 40 mg/L for 48h, and the cells were treated with 25 mg/L DDP as positive control. The proliferation inhibitory rate was evaluated by MTT assay. Induction of cell apoptosis rate was determined by TUNEL method. The expression of fas and fasL mRNA was detected by semi-quantitive RT-PCR.ResultsCompared with control group, the inhibitory rate was increased obviously（P﹤0.01）, the apoptotic rate was increased markedly(P<0.01).The expression of fas mRNA was increased significantly(P<0.05 or P<0.01), and fasL mRNA was decreased markedly(P<0.05 or P<0.01) in STE groups. ConclusionSTE can induce apoptosis by up-regulating expression of fas and fasL genes, and inhibiting the development of A549 cells.

　　Key wordsSolanum lyratum Thunb.；  A549 cells；  Apoptosis；  Fas；  FasL
   
　　白英Solanum lyratum Thunb.，ST为茄科植物，又称白毛藤，临床常用于鼻咽癌、肺癌、肝癌、肺癌、食道癌、胃癌等多种癌症［1］。研究发现，白英提取液（STE）可通过上调fas和下调fasL基因表达，诱导Hela细胞凋亡［2］。本研究通过体外细胞培养，观察STE诱导人肺癌A549细胞凋亡及其对fas/fasL基因表达的影响，探讨ST对肺癌作用的可能分子机制，为肺癌防治提供实验依据。

　　1  器材与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  细胞 

　　人肺癌A549细胞株由中科院上海细胞生物研究所细胞库提供。

　　1.1.2 试剂与仪器

　　胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品，四甲基偶氮唑蓝（MTT）为上海普飞生物技术有限公司产品，原位细胞凋亡检测试剂盒为北京中杉金桥生物技术公司产品，总RNA提取试剂盒为BIODEV-TECH公司产品，Access RT-PCR system为Promega公司产品，PCR引物为上海生物工程公司合成。KHB K3 酶标仪(芬兰), 倒置显微镜(Cioc)，BX51型显微镜（OLYMPUS），PCR仪（杭州郎基）。

　　1.2 方法

　　1.2.1  STE的制备  

　　取ST(购买于江西南华医药有限公司中药材分公司，产地安徽)干品50 g，用500 ml水浸泡1 h，加热煮沸后小火煎熬60 min，室温冷却，120目网筛过滤，弃药渣，滤液离心(3 000 r/m，20 min，2次)。取上清液，浓缩至50 ml，调pH值为7.0～7.2，0.22 μm过滤除菌，获生药含量为1.0 g/ml STE，-20℃保存备用，实验时将含10%胎牛血清RPMI 1640培养液稀释至所需的药物浓度。

　　1.2.2 细胞培养和药物处理  

　　人肺癌A549细胞，以含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、10% FBS的RPMI 1640培养液，在37℃，5% CO2的培养箱中培养，细胞生长至对数增殖期，更换含0，10，20 mg/ml和40 mg/ml STE新鲜培养液，用DDP（25 mg/L）为阳性对照组，药物作用时间均为48 h。

　　1.2.3  癌细胞毒性实验（MTT法） 
　　
　　将对数生长期的肺癌A549细胞移入96孔培养板中，细胞密度约1×104个/ ml，每孔加入200 μl细胞悬液，培养24 h。弃掉孔内原培养液，加入含STE的含10%胎牛血清RPMI1640培养液200 μl。每个药物浓度设4个平行复孔，另设DDP作用的阳性对照组和空白对照孔。培养48 h，到终止培养前4h，每孔加入MTT（5 mg/ml）20 μl，继续培养4 h后终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入DMSO 150 μl，用振荡混合仪振荡10 min，使结晶充分溶解。选择492 nm波长酶标仪测定每孔光吸收值(OD值)。实验重复3次。按公式抑制率：抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

　　1.2.4  TUNEL法检测细胞凋亡  

　　细胞凋亡检测步骤按原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。药物作用后，收集各组细胞，用PBS漂洗两遍后进行细胞涂片，风干后丙酮固定15 min；细胞在渗透液(0.2%Triton X-100, 0.1%柠檬酸钠)中孵育5 min，双蒸水冲洗玻片；滴加TUNEL反应混合物，37℃湿盒中孵育30 min；滴加转化剂-POD，37℃湿盒中孵育30 min，冲洗玻片；滴加DAB底物溶液，室温5～10 min；蒸馏水冲洗，苏木素复染、脱水、封片；以不加TUNEL反应混合液作为阴性对照片。细胞核呈棕黄色为TUNEL反应阳性细胞(即凋亡细胞)。光镜下分析结果，随机计数10个高倍视野下阳性细胞所占百分数即为细胞凋亡率。

　　1.2.5  半定量RT-PCR检测基因mRNA表达 

　　按总RNA提取试剂盒的说明书提取RNA。引物借助primer premier 5.0软件设计，并经Genebank验证(表1)。按试剂盒说明采用一步法进行RT-PCR。RT-PCR反应体系总体积50 μl，逆转录45℃，45 min，AMV RT灭活和预变性94℃，2 min，然后进行PCR 35个循环（94℃，30 s；55℃，1 min；72℃，2 min），最后延伸72℃，7 min, 终止于4℃。各取PCR产物10 μl，加溴酚蓝指示剂2 μl，于1.5%琼脂糖凝胶上电泳约1 h（电压90V），用紫外透射分析仪观察结果，并通过凝胶图像密度扫描仪扫描分析各条带的光密度，以β-actin的表达量为对照并比较各组fas和fasL的相对表达量。表1  RT-PCR引物（略）

　　1.2.6  统计学方法   

　　实验数据采用±s表示，用SPSS11.5统计软件对实验数据进行处理，两组间比较采用t检验。

　　2  结果

　　2.1  各组A549细胞增殖抑制率的比较 

　　与正常对照组相比，STE各浓度组A549细胞增殖抑制率显著升高（P<0.01），且呈一定的剂量依赖性。见表2。表2  各组A549细胞增殖抑制率的比较(略)

　　2.2  各组A549细胞凋亡率的比较   

　　正常对照组，10，20，40 mg/ml STE组和DDP组细胞的TUNEL反应阳性率（即细胞凋亡率）分别为（5.33±1.42）%，（17.14±2.74）%，（27.46±3.58）%，(43.10±4.23）%和（67.08±5.76)%。与正常对照组相比，STE各浓度组细胞凋亡率显著上升（P﹤0.01）。

　　2.3  各组A549细胞fas和fasL mRNA表达的比较  

　　药物处理癌细胞后，随着STE浓度的升高，A549细胞fas mRNA RT-PCR产物条带逐渐变粗变亮，见图1，而fasL mRNA RT-PCR产物条带逐渐变细变暗，见图2；3次结果经光密度扫描分析可见：与正常组相比较，STE各浓度组fas/β-actin光密度积分值之比显著增高（P﹤0.05或P﹤0.01），fasL/β-actin光密度积分值之比随浓度明显降低（P﹤0.05或P﹤0.01），见图3～4。

　　3  讨论

    ST属于传统的抗肿瘤中草药，其茎和果实含有龙葵碱，全草主要含甾体生物碱，其性味苦、辛、微寒。从中药药理功能分析，ST具有清热利湿、解毒消肿、祛风化痰和抗癌等功效。本实验发现，STE对A549细胞具有较强的细胞增殖抑制作用，且呈一定的时间剂量依赖性；STE处理组的细胞凋亡率明显高于正常对照组。提示一定浓度的STE对人肺癌A549细胞具有较强的杀伤能力，并能诱导癌细胞凋亡。

　　Fas /fasL系统是肿瘤细胞凋亡的重要途径之一，许多化疗药物和中药诱导肿瘤细胞凋亡的机制是通过在不同水平参与fas/fasL凋亡信号级联反应来实现的。同时，Fas /fasL系统也是细胞免疫中T淋巴细胞和NK细胞杀伤肿瘤细胞的途径之一。大多数肿瘤细胞都同时表达fas和fasL，当外界fasL和肿瘤细胞表面的fas结合之后，可使caspase家族成员以类似于酶原激活的方式相互激活，并形成级联放大效应，效应性caspase酶被激活后，可裂解一些重要蛋白，从而引起细胞凋亡［3］。细胞fas基因表达越高，其通过与自身的fasL相互作用引起细胞的凋亡，即自杀的能力越强。而肿瘤细胞表达fasL可能与其逃脱机体免疫细胞杀伤有关，已知B淋巴细胞、T淋巴细胞及NK细胞都有fas表达，特别是活化的T淋巴细胞其fas表达的水平更高，当这些表达fas的免疫细胞与表达fasL的肿瘤细胞结合后可能会激活fas/fasL信号传导途径，引起免疫细胞的凋亡，从而使肿瘤细胞逃避了免疫杀伤，许多肿瘤细胞通过fas表达下调和(或)fasL上调实现免疫逃避［4］。本实验中发现，STE可明显地上调A549细胞fas mRNA和下调fasL mRNA表达。提示ST可影响A549细胞的fas和fasL基因表达，从而通过fas/fasL细胞凋亡系统促使癌细胞发生凋亡，这可能是白英抑制肺癌A549细胞增殖作用的机制之一。

【】
  　　［1］吴婉莹，高志刚，李云谷, 等. 白英与欧白英的化学成分与药理活性［J］.国外医学. 植物药分册，2001，16（6）：245.

　　［2］韦星，李朝敢，农嵩，等. 白英提取液对Hela细胞凋亡及Fas/FasL基因表达的影响［J］.中药材，2006,29(11):1203.

　　［3］管增伟，王盛兰．半胱氨酸蛋白酶与细胞凋亡［J］.国外医学肿瘤分册，2000，27(5)：280．

　　［4］高德宗．Fas系统与肿瘤［J］.国外医学·肿瘤学分册， 2005，32(5)：368.