三七非皂苷类成分分析方法研究进展

                        作者：刘波，吴燕红，沈嘉茵，朱盛山

【摘要】  　　目的为三七提取的工艺研究提供有效的分析方法。方法对近年来国内外有关三七中非皂苷成分分析方法的大量进行。结果所综述的分析方法都在非皂苷成分的含量测定中都取得了成功。结论综述非皂苷成分的分析方法对三七的提取工艺有着重要意义。

【关键词】  三七； 非皂苷； 分析方法

　　Abstract：ObjectiveTo provide effective analysis methods for extraction technology in Sanqi.MethodsIt is aggreated by collecting lots of documents home and abroad on analysis methods of non-saponin constituents in Sanqi.ResultsThe analysis methods we summarized succeed in the determination of non-saponin constituents.ConclusionThe overview on analysis methods of non-saponin constituents in Sanqi is important to the establishment of extraction technology in Sanqi.

　　Key words：Sanqi;  Non-saponin;  Analysis method
   
　　三七是云南道地特产中药材,来源于五加科人参属植物Panax notoginseng－(Burk. ) F. H. Chen 的干燥根，主产于云南省文山州。三七主要含有皂苷、多糖、氨基酸等多种化学成分。三七总皂苷含有人参皂苷Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rf，Rg1，Rg2，Rh1 和三七皂苷R1，R2，R3，R4，R6 等20 余种皂苷成分。其中人参皂苷Rb1 (Rb1) 、人参皂苷Rg1 (Rg1) 是三七总皂苷中含量最高的两个成分,而三七皂苷R1 (R1) 则是三七总皂苷的特征化合物，但含量较低。三七皂苷的测定方法主要有：HPLC法、比色法、薄层扫描法等。很多人已对三七皂苷的检测与分析方法进行了综述，如饶高雄［1］、陆方等［2］。越来越多的研究揭示了三七皂苷在抗菌、抗肿瘤、调节机体代谢及免疫、心血管疾病和糖尿病等方面具有良好的前景［3］。近年来的研究还表明，三七中的非皂苷成分如：挥发油、黄酮类成分、糖类成分、氨基酸成分、微量元素等也具有很好的生物活性，但是非皂苷成分分析方法的综述尚未报道。本文重点就三七中的常见的非皂苷类成分的检测和分析方法进行较全面的综述。

　　1  三七中挥发油成分的测定

    三七中的挥发油具有强烈三七香气。挥发油总油中分离鉴定出34种化合物［4］，主要有酮、烯烃、环烷烃、倍半萜类、脂肪酸酯、苯取代物、萘取代物。在医药上三七挥发油具有微弱消毒及杀菌作用，局部有刺激作用，可松弛肌肉或有兴奋作用，内服可促进胃肠蠕动和泻下。三七中的部分挥发油更有抑制大脑延髓，镇静安神等特殊活性，其中β-榄香烯具有抗癌作用。
   
　　胥聪等［5］运用气相色谱-质谱联用和标准图谱，对三七花挥发油化学成分进行了分析研究。气相色谱条件为：30 m×0.25 mm SE-54石英毛细管柱；柱温80～200℃（3℃·min-1）；柱前压力6p·h-2；载气：He；气化室温度230℃；进样量0.2 μl。质谱测定条件：电离方式EI；源温度170℃；倍增电压1 200 V；电离电压70eV；发射电流0.25 mA；扫描范围35～350；扫描速度1次/s。最终气相色谱测出106个峰，质谱测出59个化合物，从中鉴定出37种成分，并测定其相对含量，以倍半萜类化合物为主。

    施丽娜等［6］用气相色谱-质谱联用并利用标准质谱图集分析了市售三七药材挥发油的组成，从中鉴定了34种成分，测定了相对含量，其中有13个倍半萜烯和2个倍半萜醇。
   
　　吕晴等［7］采用自制的同时蒸馏萃取装置提取（水蒸气蒸馏，乙醚萃取）云南文山三七花的挥发油成分，然后经气相色谱-质谱联用仪测定。结果挥发油中共分离出91个成分，鉴定了53个化合物，主要为萜烯类及其含氧衍生物（71.15%）。该方法提取和测定挥发油高效、适用、准确。

　　2  三七中糖类成分的测定

    三七含有单糖、鼠李糖、木糖、葡萄糖以及低聚糖和多糖。多糖是三七的有效成分之一,具有多方面的生理活性，部分多糖具有抗肿瘤活性。三七多糖还具有增强免疫功能等活性［8］, 毒性很低，在较低剂量即有效,对增强T细胞功能有较高的选择性。院上海药物研究所1987年对三七多糖进行了分离纯化, 证明其PNB组分有较强的免疫活性。PNB为分子量110,000道尔顿的杂多糖,由阿位伯糖及半乳糖组成, 其摩尔比为0.61∶1。
   
　　刘刚等［9］采用3，5-二硝基水杨酸法测定了三七和三七根茎中总糖和还原糖的含量。将样品、蒸馏水和3，5-二硝基水杨酸混合均匀，在沸水浴中加热5 min，随后冷水冷却，最后于722分光光度计520 nm处测定吸光度A。结果总糖和还原糖的回收率分别为：98.78%(RSD=0.78%)，99.29%（RSD=0.23%）。
   
　　崔秀明等［10］采用苯酚-硫酸比色法分析不同产地、不同规格、不同采收期三七中的多糖含量，并考察其变化。作者取样品溶液于具塞试管中，加水至0.4 ml，加入5 %苯酚0. 2  ml混匀，迅速加入浓硫酸1 ml,摇匀，沸水浴加热20 min，取出，迅速在冰上冷却，用Beckman 650UV/ V 分光光度计于490 nm 处测定吸光度A。结果显示，加样回收率为99%，效果较好，可作为检测三七中多糖成分的有效方法。

　　3  三七中脂肪酸成分的测定

    三七种子进行风干后，用索氏提取器提取得到种仁油。种仁油呈淡黄色，具有三七特有的香气，其组成主要为脂肪酸。

    鲁歧等［11］用GC法分析测定了人参属植物的脂肪酸含量。其GC条件为：氯离子化检测器，量程2，衰减4；担体：Gas Chromsorb Q 100-200目；固定液为DEGS；色谱柱为毛细管玻璃柱（300 mm×32 mm）；固定相配比5%；载气流速：氮气50 ml·min-1，氢气60 ml·min-1，空气500 ml·min-1；柱温180℃，气化室温度240℃，检测室温度240℃。最后确定三七脂肪酸的组成：棕榈酸18.02%，油酸14.14%，亚油酸62.80%，亚麻油酸5.04%。
   
　　刘润民等［12］用气相色谱法鉴定了三七种仁油脂肪酸的组成。作者对种仁油进行皂化，总脂肪酸得率为73.3%，不皂化物2.0%。总脂肪酸甲酯化后用气相色谱法分析，其条件为：(1)SE-54-30 m毛细管柱， 柱温80-200℃，程序升温3℃·min-1，进样量0.1 μl；(2)10%DEGS／CHRO填充柱，柱温180℃，进样量0.13 μl。结合红外光谱法（IR）确定了脂肪酸的组成为：棕榈酸3.0%，硬脂酸0.54％，花生酸0.46%，棕榈油酸0.53%，油酸87.48%，亚油酸7.07% ，亚油烯酸0.21%。不皂化物用IR进行分析，确定其组成为羽扇豆醇，白桦脂醇，16β-羟基羽扇豆醇和豆甾醇。由此可见，红外光谱和气相色谱相结合可有效地鉴定三七种仁油中的成分和测定其各自的含量。

　　4  三七中黄酮成分的测定

    三七绒根中含有少量的黄酮类成分,魏均娴等［13］ 从中分离出两种黄酮类成分：一种是槲皮素，另外一种苷元为槲皮素，糖元鉴定为木糖、葡萄糖和葡萄糖酸，糖的连接次序及位置未定。

    郑莹等［14］从三七茎叶中分离得到6个黄酮类单体化合物，分别为：山柰酚、槲皮素、山柰酚-7-O-α-L-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-β-D-半乳糖苷、山柰酚-3-O-β-D-半乳糖葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖（2→1）葡萄糖苷。
   
　　槲皮素及其导入亲水性基团后的衍生物，具有祛痰、止咳、平喘、强心、降血压、扩冠、降血酯、抗炎、抗过敏、解痉、抗癌、抗出血作用，可作为治疗循环障碍、动脉粥样硬化及闭塞性脑血管疾病药物。三七黄酮与皂苷合用, 生理活性最强, 分开使用则证明黄酮能显著增加心肌冠脉流量。
   
　　张仕秀［15］采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法对三七茎叶内的黄酮类物质含量进行了初步测定。作者采用索氏提取法70%的乙醇为溶剂加热回流4 h，过滤，取滤液加5%NaNO2 溶液，放置6 min，加10%Al（NO3）3 ，反应生成红色络合物，再放置6 min，加4%NaOH溶液加水放置15 min，在500 nm处测定吸光度，测定效果可行。

    郑莹等［16］用RP-HPLC法测定了三七叶中两种主要的黄酮类成分：山柰酚-3-O-β-D-半乳糖（2 →1）葡萄糖苷(Ⅰ)和槲皮素-3-O-β-D-半乳糖（2 →1）葡萄糖苷（Ⅱ）的含量。采用ZORBAX Extend C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.15%乙酸水溶液（35：65），流速1.2 ml·min-1，检测波长268 nm，柱温25℃。结果显示，化合物Ⅰ的平均加样回收率为97.5%，RSD为0.78%；化合物Ⅱ的平均加样回收率为101.8%，RSD为1.1%。该方法简便快捷，准确度高。

　　5  三七中三七素的测定

    文山三七中含有19种以上的氨基酸，有7种是体内必需的［17］，其中一种特殊氨基酸称为三七素（dencichine），具有非常好的止血作用。人参属的几种名贵中药均含有止血成分三七素，但以三七含量最高（0.90％），人参次之（0.50％），西洋参最低（0.31％），因此，三七的止血活性最好。三七素的结构为：
   
　　1981年日本小菅卓夫首次从三七中得到了三七素并证明有止血活性。

    付春梅等［18］用HPLC法测定了三七及其制剂中三七素的含量。迪马DiamonsilTM C18色谱柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)，自填国产CYW C18保护柱(10 mm×4.5 mm，5 μm)，流动相为含3.5 mmol·L-1磷酸二氢钠的甲醇-0.03%四丁基氢氧化胺(20∶80，磷酸调pH为3.8)，体积流量为1 ml·min-1，柱温40℃，检测波长为220 nm，进样量为20 μl。结果显示平均加样回收率为98.8%，RSD为1.7%。
   
　　朱静等［19］采用柱前衍生化高效液相色谱法测定了三七及其制剂中三七素的含量。以硼砂缓冲液(pH 9.18)为提取溶剂，回流提取药材及制剂中的三七素；以氯甲酸芴甲酯( FMOC)作为衍生化试剂，对三七素提取液进行柱前衍生化，采用RP-HPLC，ODS柱分离，并通过紫外检测的方法进行测定。结果三七素的线性范围为1.76～352 mg·L - 1 ，最低检测限为60μg·L - 1。衍生化产物稳定，过量的衍生化试剂无干扰。平均加样回收率为95.3%, RSD为1.7%。该方法操作简单，快速，灵敏度高，可用于三七药材及制剂中三七素的分析测定和三七素的药物代谢研究。

   
　　鲁歧等［20］用氨基酸自动分析仪测定了三七中三七素的含量。首先是三七素的分离，采用渗漉法用甲醇进行洗脱，渗漉液用等量的水饱和正丁醇反复萃取，其中水层浓缩后加到Sephadex LH-20凝胶柱（2.6×100 cm）上蒸馏水洗脱。然后对各管流出液进行纸层析。展开剂：（A）n、AuOH-HAC-H2O（4∶1∶1），（B）n-BuOH-HAC-EtOH- H2O（4∶1∶1∶2）。显色剂：茚三酮。显色温度：110℃。合并与标准品斑点颜色及Rf相同的流出液，然后加到CM Sephadex C-25离子交换层析柱（3.0×60 cm）上，用纯蒸馏水洗脱。流速、收集方法及纸层析检识方法同上。最后放置，析出晶体。水中重结晶，得精制无色板状结晶。再用氨基酸自动分析仪测定，以标准品的进样量与其测得峰面积求得Fact值，再根据Fact和样品的峰面积，求得样品进样量中三七素的毫克数。

    章观德等［21］利用三七素与衍生化试剂荧光胺反应产生强烈荧光的特性测定了三七中三七素的含量。反应原理如下：

    三七素衍生化后进行薄层层析，展开剂采用混合溶剂乙醇-丙酮-水-浓氨水（2.5∶1.7∶0.8∶0.5），此时Rf=0.39，紫外灯下呈亮黄绿色荧光；随后进行薄层扫描，激发波长为395 nm，选择发射滤光片，以二号滤光片最佳，基线噪音小，灵敏度高。结果显示；三七素对照品在10～83 ng范围内是通过原点的直线，相关系数r=0.999 9，精密度为RSD为2.09%。实验还通过比较层析前后荧光衍生化发现，将样品在试管中进行衍生化，然后将反应溶液点在薄层上，测定荧光强度，即层前衍生化效果较好。因为三七素在水溶液中不稳定，放置一星期后薄层层析，在三七素的斑点上方出现另一斑点，样品的水溶液放置后也有相应斑点存在。因此对照品用10%丙醇或50%乙醇配置溶液，低温可保存数周。三七素荧光胺衍生物在生成后30 min响应值逐渐降低，因此衍生化反应后溶液应随即点样层析测定。

　　6  三七中微量元素的测定

    随着中药生产的化和精细化, 在人工栽培过程中, 若不考虑三七的生长、生理需求和根据土壤中矿质元素含量, 确定化肥的最佳用量、施用日期以及营养元素的最佳比例, 则会对三七体内有机化合物代谢产生不利影响。三七中某些微量元素对人体有重要生理作用。现代研究表明，微量元素与人体的内分泌、生长发育、免疫和感染、致畸形、肿瘤、心血管疾病、创伤愈合等密切相关。因此对三七中的微量元素进行测定非常有必要。

    三七中微量元素的检测方法主要有原子吸收分光光谱法、原子荧光光谱法。

    李学章等［22］用原子吸收法测定了三七中的铜、镉和锂的含量。优化的最佳仪器工作条件见表1(902AB型原子吸收光谱仪)。表1  铜、镉、锂测定的最佳仪器工作条件（略）

    铜、镉、锂的检出限分别为：0.002 3 μg·ml-1,0.002 6 μg·ml-1和0.002 0 μg·ml-1，精密度RSD分别为：2.50%,10.08%和9.92%，回收率分别在96%～103%，92%～108%和96%～104%之间。表明该方法准确、灵敏度高、切实可行。
   
　　刘世熙等［23］用微波消解、流动注射-氢化物发生原子荧光光谱法测定了三七中的硒含量。实验最优的测定条件见表2（AF-610A 原子荧光光谱仪）。表2  硒含量测定的最优条件（略）

    该方法的检出限为0.30μg·L-1，相对标准偏差为1.2%，线性范围为0～100μg·L-1，相关系数为0.999 9，回收率为96.7%～100.7%。表明该方法具有消化效率高、损失小、测定简便、快速、准确的特点。

　　7 

    本文较全面地总结了近年来三七中非皂苷类成分的分析方法。以上各分析方法都在非皂苷类成分的定量分析中取得了成功。随着技术的不断进步，三七中非皂苷成分的分析方法将会朝着更灵敏、更便捷、更环保、高通量、高精度的方向。

【】
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