叶酸介导靶向砒霜纳米粒的实验研究
【摘要】 目的 研究叶酸偶联牛血清白蛋白的合成工艺，制备包裹砒霜的白蛋白纳米粒并检验其对靶细胞的杀伤作用。方法叶酸在缩合剂的作用下与牛血清白蛋白偶联，通过正交设计选择最佳配方；用去溶剂法制备包裹砒霜的纳米粒，并观察其对靶细胞特异性杀伤作用。结果采用最佳条件合成的叶酸偶联牛血清白蛋白的偶联率为30.31 μg/mg，纳米粒的砒霜包封率为10.3%，对靶细胞杀伤率为97%，对非靶细胞的杀伤力仅为23%。结论 包裹有砒霜的叶酸偶联牛血清白蛋白纳米粒（简称F-BSANP）对靶细胞有特异性杀伤作用。
【关键词】 砒霜；纳米粒；叶酸；牛血清白蛋白
Abstract：ObjectiveTo study the synthetic procedure of folate-conjugated bovine serum albumin (F-BSA) and preparation of albumin nanoparticles entrapping arsenic trioxide，and to examine the peculiar toxicity of nanoparticles on targeting cells.MethodsFolic acid was conjugated to bovine serum albumin via condensing agent，we studied the best synthetic formula of F-BSA by the orthogonal test design．The nanoparticles were prepared by desolvation method，and the peculiar toxicity of F-BSANP on A549 was studied．ResultsThe average conjugating rate of folate in F-BSA made in the best formula was 30.31μg/mg．The entrapping rate of arsenic trioxide was 8.34%．We examined the peculiar toxicity of F-BSANP on targeting cells and control group cells，respectively，and the death rate of targeting cells was 97 percent ,whereas that of control group was only 23 percent．ConclusionF-BSANP is peculiar to their targeting-cells．
Key words：Arsenic trioxide； Nanoparticles； Folate； Bovine serum albumin
肿瘤是严重危害人类生命和健康的常见病和多发病，是导致残疾和早死的主要疾病之一。目前，临床使用的抗肿瘤化疗药物均有较大的毒副作用，有些严重的毒副反应是限制药物剂量或使用的直接原因。研究发现，在多种肿瘤细胞(如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌等)膜表面上的叶酸受体活性和数量显著高于一般正常细胞，这为叶酸受体介导药物靶向于肿瘤细胞的研究奠定了基础［1］ 。
中药砒霜（三氧化二砷）是中药中的传统毒药，近年来有关其抗肿瘤作用，尤其是在我国率先开展的三氧化二砷急性早幼粒细胞性白血病(APL)的研究引起了人们的广泛兴趣；研究已发现砒霜能显著抑制人肺癌的细胞生长并诱导其凋亡［2］ 。但是,在治疗过程中的严重毒副作用是影响其抗癌疗效的主要原因。
本实验以传统中药砒霜为治疗药物，将其包裹在用叶酸偶联白蛋白制成的纳米粒中，并进行其对靶细胞杀伤作用的研究。为以后制备其它抗癌药靶向制剂作铺垫。
1 材料
人肺癌细胞株A549（购于武汉大学生命院典型培养物保藏中心）；人骨髓间充质干细胞；分离自正常人骨髓血（骨髓血样由南昌大学医学院一附院血液科提供）；牛血清白蛋白（上海新量化工试剂有限公司）；叶酸（上海新量化工试剂有限公司）；1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）碳二亚胺盐酸盐（简称EDC·HCl）（上海三杰生物技术有限公司）；Sephadex G-25 （Pharmacia）；三氧化二砷（购自上海化学试剂采购供应站，CP）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI 1640 培养基（Gibco）；胰蛋白酶 1∶250（Amresco）。
2 方法和结果
2.1 叶酸偶联白蛋白的合成
2.1.1 叶酸偶联白蛋白的合成与分离
将叶酸溶于pH7.4的磷酸缓冲液(PBS)中，加入EDC·HCl后搅拌活化5 min，再加入50 mg/ml牛血清白蛋白的PBS溶液，搅拌下反应数小时即得［3］。将反应液过Sephadex G-25柱，收集前段淡黄色有乳光部分［4］。
2.1.2 因素和水平的确定
经过查阅相关资料和大量的预实验最终确定叶酸用量、EDC·HCl与叶酸摩尔比、反应时间3因素各取3水平优化工艺。见表1。表1 因素水平（略）
2.1.3 评价指标的选取与测定
叶酸与牛血清白蛋白偶联越多，纳米粒对肿瘤的靶向性就越高。因此选择叶酸与牛血清白蛋白偶联率作为评价指标。
偶联率的测定，将叶酸偶联白蛋白溶于pH7.4的PBS中，用2.5%的胰蛋白酶消化2 h后离心取上清液于358 nm处测紫外吸收。标准曲线法定量，偶联率。
偶联率=被偶联的叶酸量/μg被偶联的牛血清白蛋白量/mg
2.1.4 正交实验结果
按正交设计表L9(34)进行实验，计算偶联率（见表2），方差分析结果见表3。表2 正交设计（略）表3 方差分析表（略）
X1，X2和X3分别是各因素水平1、水平2、水平3偶联率之和；△X是各因素内部水平1、水平2、水平3偶联率之和的最大差距
由表3～4可见,在考察的3个因素中, EDC/folate影响最大(P<0.05),而叶酸用量与反应时间几乎没有影响(P>0.05),叶酸偶联白蛋白合成工艺最佳水平组合为A3B3C1，以该工艺制备的叶酸偶联白蛋白的叶酸偶联率为30.31μg/mg。
2.2 纳米粒的制备
2.2.1 砷标准曲线的测定
按新银盐法［5］测定并砷标准曲线，C=9.106A+0.908 3，r=0.993 9，RSD为2.41%。在1～6μg浓度范围内，线性良好。
2.2.2 载药纳米粒的制备［6］
As2O3溶于牛血清白蛋白溶液中，调节pH值微碱性，室温下缓缓加入无水乙醇，搅拌30 min后再缓缓加入戊二醛溶液［7］ ，固化12 h即得。制得包封率为10.3%的纳米粒。
2.2.3 包封率的测定
取载药纳米粒用pH7.4的PBS分散，加入2.5%的胰蛋白酶消化2 h，离心后取上清液新银盐法测定其吸光度A值，计算出砷含量。
包封率（%）=纳米粒中所包裹的As2O3量投入As2O3的量×100%
2.2.3 空白回收率和加样回收率的测定
经测定，空白回收率为100.8%，加样回收率为97.9%。
2.2.4 纳米粒的形态观察和粒径
纳米粒分散于蒸馏水中，用HITACHI H-600透射显微镜观察粒子形态，并拍摄照片。纳米粒形态圆整，分布均匀，粒径大约200 nm左右。见图1～2。
2.3 细胞毒性实验［8］
将A549细胞培养于10%小牛血清的1640培养基中。设立空白对照组（加生理盐水）、载药叶酸偶联白蛋白纳米粒3个剂量组（10，1，0.1 μg/ml）、阻断组(载药1 μg/ml的叶酸偶联白蛋白纳米粒+叶酸)、载药白蛋白纳米粒(BSANP)组（1μg/ml）、砒霜组（1μg/ml）。培养24 h后，MTT法测定各孔及本底A490，计算细胞抑制率。
取正常人骨髓血3 ml，培养数天后分离贴壁细胞即得人骨髓间充质干细胞［9］。同法操作计算细胞抑制率。结果见表4。表4 靶细胞与非靶细胞的抑制率(略)
用t检验对实验结果进行分析，结果显示包裹砒霜的F-BSANP对靶细胞的抑制作用较非靶细胞明显；较BSANP组，叶酸阻断组与砒霜组也显示出非常高的抑制作用，差异具有显著性。
3 讨论
本实验中选择人骨髓间充质干细胞作为对照用的非靶细胞，主要是因为人骨髓间充质干细胞具有很强的增殖分化能力，与肿瘤细胞有相似之处。
包裹有砒霜的F-BSANP组对靶细胞的杀伤作用较非靶细胞、BSANP组和砒霜组明显，证明F-BSANP对靶细胞具有特异性杀伤作用；而包裹有砒霜的F-BSANP组对靶细胞的杀伤作用较叶酸阻断组明显也从侧面证明纳米粒的靶向性是通过叶酸介导入细胞而发挥作用；叶酸阻断组和BSANP组也存在显著差异，这可能是因为叶酸和叶酸偶联白蛋白纳米粒与叶酸受体是竞争性结合，在这个过程中也有部分叶酸偶联白蛋白纳米粒与叶酸受体结合而把药物介导入细胞内。
本实验中，在温和的条件下成功合成叶酸偶联牛血清白蛋白；在保证生理活性的前提下制备的偶联物可以做为靶向制剂的一种高分子材料，对传统中药砒霜进行包裹制成的纳米粒具有明显的主动靶向性，并且安全性高；在体内的过程及体内的药效有待于进一步的研究。另外，以叶酸偶联白蛋白纳米粒做为载体将市场上的抗肿瘤药物进行二次开发，应用前景广阔。
【】
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