余甘子叶提取物体外抗肿瘤作用研究
【摘要】 目的 研究余甘子叶提取物在体外是否具有抗肿瘤作用，并确定其抗肿瘤有效部位。方法采用渗漉法及加热回流法提取分离余甘子叶不同成分；采用MTT法、集落形成法观察余甘子叶各种提取物对白血病细胞株L1210和P388D1，宫颈癌细胞株Hela、胃癌细胞株SGC7901、黑色素瘤细胞株B16、神经性肿瘤细胞株NG108-15、肝癌细胞株Bele7404的生长抑制影响，并确定其抗肿瘤活性部位。结果从余甘子叶中提取到具有较广泛药理作用的G1，G2，A，B，C，D，E，bb，cc，dd，ee等11个部位。各部位提取物对白血病细胞株L1210和P388D1，宫颈癌细胞株Hela，胃癌细胞株SGC7901，黑色素瘤细胞株B16，神经性肿瘤细胞株NG108-15，肝癌细胞株Bele7404等7种肿瘤细胞株的增殖均有不同程度的抑制作用，其中cc部位的作用最强。结论余甘子叶提取物具有体外抗肿瘤活性，有效成分主要集中在cc部位。
【关键词】 余甘子叶； 提取物； 肿瘤细胞株； 抗癌作用
Abstract:ObjectiveTo study the anti-tumor effect of extracts from leaves of Phyllanthus emblica L. in vitro, and provide experimental reliance for the exploitation of the leaves of Phyllanthus emblica L. Methods①Seeping method and heat-back flow was used to extract 11 parts from leaves of Phyllanthus emblica L. ② To sieve the anti-tumor activity of the active parts extracted from leaves of Phyllanthus emblica L by MTT and clone cells assay. ResultsEleven pats had been extracted from the leaves of Phyllanthus emblica L.,such as G1,G2,A，B，C，D，E，bb，cc，dd and ee.The different parts could restrain the cell proliferation with different degrees in the lymphocytic leukemia L1210,lymphoid neoplasm P388D1,tumor of cervix uteri Hela,the stomach carcinoma SGC7901,melanoma B16,mouse neuroblastomax rat gliom hybrid NG108-15,and a human hepatocellular carcinoma Bele7404 cell strains.Among all the parts,the cc part was the strongest.ConclusionThe extracts of the leaves of Phyllanthus emblica L.have the anti-tumor activity, concentrating at the cc part.
Key words:The leaves of Phyllanthus emblica L.； Extracts; Carcinoma cell ling; anti-tumor activity part
余甘子叶Phyllanthus emblica L.系大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠属（Phyllanthus）落叶小乔木或灌木的叶，余甘子树在我国主要分布在福建、广东、云南、贵州、四川、海南、广西等省区，资源丰富。余甘子自古以来即被我国人民视为具有保健作用而加以利用。余甘子味甘、酸、涩，性凉。具有化痰止咳、健胃消食、清热生津、保肝解毒、抗肿瘤作用等功效。全世界约有17个国家的传统药物体系中使用了余甘子；在我国约有16个民族使用该药，其中以汉族和藏族等尤为习用［1］。余甘子是一味重要的传统民族药，己被载入多版《药典》［2］。余甘子在民间应用已比较广泛，虽然民间也常用余甘子叶肿瘤，然而，余甘子叶作用的研究报道极少。为此，我们对余甘子叶的抗肿瘤作用进行了研究。现报道如下。
1 器材与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器
RE－52AA型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂产品；CO2培养箱（Thermo Forma）,美国产，型号381；倒置显微镜（Olympus），日本产，型号CK40；酶标仪（Biocell），奥地利产，型号Sunrise。
1.1.2 试剂
石油醚，分析纯60～90℃，北京长海化工厂产品，批号200403122；三氯甲烷，化学纯，广东汕头市西陇化工厂产品，批号020409 2乙酸乙酯：分析纯，北京化学试剂公司产品，批号030411；正丁醇，分析纯，上海化学试剂有限公司产品，批号0404101；95%醇，化学纯，广东汕头市西陇化工厂产品，批号020824 1；MTT（四甲基噻唑蓝）为德国Sigma公司产品，批号020609；FBS（胚胎牛血清）美国Hyclone公司产品，批号0407；RPMI1640培养基，美国GIBCO公司产品，批号1120708；DMEM培养基，美国GIBCO公司产品,批号1181947；DMSO(二甲基亚砜)购自天津汇英化学试剂有限公司产品，批号20030526。
1.1.3 细胞株
白血病细胞株L1210和P388D1、宫颈癌细胞株Hela、人胃癌细胞株SGC7901、黑色素瘤细胞株B16、神经肿瘤细胞株NG108-15、人肝癌细胞株Bele7404均购自上海细胞生物研究所细胞库；HBV-DNA克隆转染人肝癌细胞的2.2.15细胞系，由美国Mount Sinai医学中心构建，购自中国医学院中国医药生物技术研究所。
1.2 方法
1.2.1 余甘子叶提取物的制备
余甘子叶采自广西邕宁县，经广西中医学院刘寿养教授鉴定。采用渗漉法及加热回流法提取分离余甘子叶不同部位。
1.2.2 余甘子叶提取
物体外抗肿瘤活性研究［3］MTT法：报道［3］在96孔培养板(NUNC)中每孔加入200μl（含有5000个/ml肿瘤细胞）含10%FBS的RPMI1640培养基的细胞悬液（除NG108-15细胞用含10%FBS的DMEM培养基外），置37℃10%CO2培养箱中培养24 h后，实验组分别加入最终浓度0.5，1.0，5.0 μg/ ml的蒲葵根提取物的培养液，对照组则加入等浓度等体积溶剂的培养液，每组4孔，重复４次。置37℃，10%CO2培养箱培养5 d后，弃去上清液，加入200 μl/孔新鲜配制的含0.2 mg/ml MTT的无血清培养液,37℃继续培养4 h。弃上清液，加入200 μl DMSO,振荡混匀后,在酶标仪上以波长为550 nm,参比波长为450 nm测定OD值结果。
按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：
肿瘤细胞生长抑制率（%）= (1-实验组平均OD值/对照平均OD值)×100%
集落形成法：按文献报道［4］取对数生长期的贴壁细胞(Hela、
SGC7901、B16)用10%FBS的RPMI1640培养液和NG108-15用10%FBS的DMEM培养液配成500个/ml细胞悬液,接种于35mm培养皿(NUNC)中,4个为一组,每个2 ml；实验组加入终浓度为0.5，1.0，5.0 μg/ml的蒲葵根提取物的细胞悬液200 μl。对照组加入等浓度等体积溶剂的细胞悬液200 μl，置5%CO2的37℃培养箱中静置7d;弃去培养液,用瑞氏-姬姆萨染色后计数含50个细胞以上的细胞集落。对悬浮细胞(L1210和P388D1)用10%FBS的RPMI1640培养液配成1 000个/ml细胞悬液,置37℃预温；取35 mm培养皿(NUNC),4个为1组，实验组分别加入浓度为0.5，1.0 μg/ml，5.0 g/ ml的蒲葵根提取物，对照组则加入等体积的溶剂；取已融化的5%琼脂液1份,加入到9份37℃含15%FBS的新鲜RPMI1640培养液中,摇匀加入平皿中，每个1ml,置室温使其凝固；取预温的细胞悬液按每9.4 ml加5%琼脂0.6 ml的比例混匀,加到已铺底层琼脂的平皿中,每个1 ml,置37℃，5%CO2培养箱中培养7 d;在显微镜下计数含50个细胞以上的细胞集落。
按下列公式计算药物对细胞集落形成抑制百分率：
肿瘤细胞集落形成抑制百分率（%）= (1-实验组细胞集落数/对照组细胞集落数)×100%
1.3 统计方法结果计量资料以±s表示，EXCEL软件分析数据，两组间均数差异用t检验。
2 结果
采用渗漉法及加热回流法从余甘子叶提取分离到G1，G2，A，B，C，D，E，bb，cc，dd，ee等11个部位。
2.1 MTT法测定结果 用人肝癌细胞株Bele7404对九种余甘子叶提取物A，B，C，D，E，bb，cc，dd，ee在浓度为25～100 μg/ml的范围内进行筛选。结果见图1和表1。表1 余甘子叶提取物对Bele7404肿瘤细胞抑制率与浓度的相关性（略）
从表1可以看出，cc部位的IC50<20 μg/ml，对Bele7404肿瘤细胞株有很强的杀伤作用，且抑制率与浓度有很好的相关性，r=0.986 0；D,E,dd部位的IC50也接近于20 μg/ml，对Bele7404肿瘤细胞株也有较强的杀伤作用。
根据初筛结果，对9种余甘子叶提取物A，B，C，D，E，bb，cc，dd，ee用另外6种肿瘤细胞株神经肿瘤细胞株NG108-15，人胃癌细胞株SGC7901，宫颈癌细胞株Hela、黑色素瘤细胞株B16、白血病细胞株L1210和P388D1进行扩大筛选，结果见图2～6和表2～5。表2 余甘子叶提取物对NG108－15肿瘤细胞抑制率与浓度的相关性（略）表3 余甘子叶提取物对SGC7901肿瘤细胞抑制率与浓度的相关性（略）表5 余甘子叶提取物对P388D1肿瘤细胞抑制率与浓度的相关性（略）
从图2可以看出，在浓度为100 μg/ml时，C，D，E，cc，dd，ee，G1对NG108－15肿瘤细胞株的抑制率均超过70%；但在较低浓度25μg/ml时，仅C和cc部位对该细胞株有较强的抑制作用，抑制率均大于40%；C，cc，G1对NG108－15肿瘤细胞的抑制率与浓度成正比。
由表2可知，cc部位对NG108-15肿瘤细胞有很强的杀伤作用，其IC50为20.9 μg/ml；C和G1部位对NG108-15肿瘤细胞也有较强的抑制作用，而且抑制率与浓度有很好的相关性。
由图3可见，cc和C部位在浓度为100 μg/ml时对SGC7901肿瘤细胞的抑制率均超过70%，在较低浓度25 μg/ml时抑制率仍超过40%，可见cc和C两部位对SGC7901肿瘤细胞有较强的杀伤作用，且抑制率与浓度成正比。
由表3可见，cc部位的IC50为29.8μg/ml，接近于20μg/ml，对SGC7901肿瘤细胞株有很强的杀伤作用;C部位的作用仅次于cc部位，其IC50为41.5μg/ml。
由图4可见，在浓度为100 μg/ml时，A，cc，ee部位对Hela肿瘤细胞的抑制率均超过50%；在较低浓度25 μg/ml时，cc部位对Hela肿瘤细胞的抑制率还大于40%，可见cc部位对该细胞具有较强的抑制作用。部位A，D，dd，ee对Hela肿瘤细胞也有中等强度的抑制作用。A，D，cc，dd，ee部位对Hela肿瘤细胞抑制率与浓度相关性见表4。表4 余甘子叶提取物对Hela肿瘤细胞抑制率与浓度的相关性（略）
由表4可见，余甘子叶不同提取物对Hela肿瘤细胞仅有中等强度的抑制作用，其中cc部位的作用较强，其IC50为41.2 μg/ml。
由图5可见，余甘子叶提取物对P388D1细胞有较好的抑制作用。在浓度为100 μg/ml时，A、D，cc，dd部位对P388D1细胞的抑制作用均超过80%。E部位在25～100 μg/ml浓度范围内对P388D1细胞的抑制率均超过50%。
由表5可见，cc，D，d d部位对P388D1肿瘤细胞有较好的抑制作用，其IC50均小于40 μg/ml。
由图6可见，在浓度为100 μg/ml时，A，B，cc，dd部位对B16肿瘤细胞的抑制率均超过50%，其中cc，dd部位的抑制率达70%以上，dd部位对B16肿瘤细胞的抑制率与浓度成正比，r为0.942 4，IC50为63.3 μg/ml。
实验还对L1210细胞进行了多次筛选，但结果很不稳定，故未将实验结果列出。
综合分析余甘子叶提取物对肿瘤细胞增殖影响的筛选结果，发现cc部位有较广的抑瘤谱，对Bele7404，SGC7901，NG108-15和Hela肿瘤细胞株均有很好的抑制作用。为了进一步检查cc部位对这几个细胞增殖的影响，采用集落形成法对这几个细胞进行再筛选。结果见表6。
2.2 余甘子叶提取物cc部位对细胞集落形成的影响采用细胞集落形成法测定。结果见表6。表6 余甘子叶提取物cc部位在浓度为25 μg/ml时对Bele7404，SGC7901，NG108-15和Hela细胞集落形成的影响 （略）
由表6可以看出,集落形成法结果与MTT法结果基本一致。可见cc部位对Bele7404，SGC7901，NG108-15和Hela肿瘤细胞株均有很好的抑制作用。
3 讨论
据记载，余甘子叶含余甘子酸、蛇麻子醇、β-谷甾醇、并没食子酸、没食子酸、3，6－二没食子酰葡萄糖、鞣料云实精、诃黎勒酸、诃子酸、葡萄糖没实子鞣苷。我们对余甘子叶进行了化学成分的预实验，黄酮类的4项反应均为阳性，酚类的2项试验也均为阳性，糖、多糖、苷类的3项反应也均为阳性，鞣质的2项反应也均为阳性，也有部分植物甾醇、三萜类和有机酸类阳性反应，与文献报道基本一致。这些有效部位还只是粗提物，至于各部位的化学成分是什么，有待进一步的分离研究。我们对cc部位进行了成分预试验，结果黄酮类反应均为阳性，还有部分蒽醌类反应。可见cc部位很可能是黄酮类。
恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病，目前对恶性肿瘤的常采用手术、放疗和化疗相结合的综合措施。化疗是一种全身性治疗，并可消灭远距离转移的癌细胞，因此在综合治疗中占有很重要的地位。占化疗药物绝大多数的是细胞毒类药物，它通过干扰与细胞的生长、死亡、分化及功能等相关的机制，抑制细胞的生长甚至杀死细胞。抗肿瘤药物的筛选方法繁多，大体上分为体内与体外方法两类。其中移植性肿瘤体内筛选法是最通用的方法，可在同一时间内获得大量生长相对均匀的肿瘤以供给药及对照之用，通过动物一般状况的观察，体重的变化及死亡率，可以判断在动物耐受量下，药物是否有明显的抑制肿瘤生长的作用，这是任何体外试验所不能代替的，其结果可为抗肿瘤药物临床疗效提供有意义的根据［4］。虽然动物模型在抗肿瘤药物的评价中起重要作用，但是随着细胞毒类化合物的迅速增多，动物模型费用昂贵，周期长的缺点使其不再适合大规模的抗肿瘤药的评价，因此，肿瘤细胞体外筛选显得非常重要，能进行大样本量的筛选和一药多筛是其两大优势。本研究通过采用MTT法、集落形成法证明了余甘子叶提取物的抗癌有效部位，表明本实验所采用的方法及方案具有可行性和性，结果令人满意。
MTT法是用来筛选抗肿瘤活性成分行之有效而又简便、快速的方法，且是美国国立肿瘤研究中心所采用的抗癌药物筛选方法。MTT（四氮唑）是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲瓒，而死亡的细胞则无此功能。用DMSO（二甲基亚砜）溶解甲瓒后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率，了解药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。集落形成法反映的是单个细胞的增殖潜力，是单个细胞分裂6代或6代以上时，其后代所组成的群体（集落），能灵敏的测定抗肿瘤药的活性［4］。因此，为了进一步验证前面筛选的结果，本实验加用集落形成法进行扩大再筛选，实验结果与MTT法的结果相一致，进一步佐证了余甘子叶提取物有抗肿瘤作用，且抗瘤谱较广。
【文献】
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［4］徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2002：203，1757.
