灵芪蠲肝液对急性肝损伤内毒素和氧自由基的作用
作者：李万平，李晓冰，黄新武，肖顺汉，邓存良，陈枫，唐坤华
【摘要】 目的 通过动物实验研究灵芪蠲肝液对急性肝损伤内毒素及氧自由基的影响。方法用硫代乙酰胺复制急性肝损伤模型。检测肝功能、内毒素（ET）以及10%肝组织匀浆中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平并取肝组织做病理检查。结果硫代乙酰胺急性肝损伤时，灵芪蠲肝液能明显降低血清ALT、AST活性、TBil、MDA、ET水平，升高SOD水平，与模型组比较差异显著（P<0.05）；病理检查发现其能减轻肝细胞变性、坏死，减少炎细胞浸润。结论灵芪蠲肝液通过减少ET吸收，减少氧自由基的产生，从而保护肝细胞膜，减轻肝损伤。
【关键词】 灵芪蠲肝液；大鼠；急性肝损伤；氧自由基；内毒素
Abstract：ObjectiveTo observe the effect of LingQiJuanGan Liquor（LQL） on endotoxin and Oxygen free radicals in acute hepatic injured rats. MethodsAcute hepatic injury was induced by thioacetamide. Then hepatic function,plasma endotoxin(ET) malonyldialdehyde(MDA) and superoxide dismutuse(SOD) in were tissue were detected . Pathological changes was observed.ResultsCompared with model group , serum ALT and AST activities ,TBil , plasma ET level, and MDA level in homogenates were significantly decreased by LQL,SOD activity obviously increased. The difference was significant (P<0.05). Pathological examination found that LQL could lighten denaturalization and putrescence of hepatic cell and reduce infiltration of inflammation cell. ConclusionLQL can protect liver cellular membrane by reducing absorption of endotoxin,decreasing production of oxygen free radicals,so as to lighten acute liver injury.
Key words：LQL； Rats； Acute hepatic injury； Oxygen free radicals； Endotoxin
灵芪蠲肝液为中药灵芝、黄芪、当归、大青叶等的水提物，具有抗炎、降低转氨酶、改善食欲、防止纤维化、增加免疫力等功效。本实验旨在研究灵芪蠲肝液对硫代乙酰胺急性肝损伤内毒素及氧自由基的影响，探讨其抗肝损伤作用及机制。
1 器材与方法
1.1 材料
1.1.1 药品及试剂
灵芪蠲肝液（LQL）,17 g(生药)/20 ml,由泸州医学院附属制剂中心生产，批号200403。硫代乙酰胺(Thioacetamide,TAA),由北京化学试剂三厂生产，批号920314。乙醚，天津市化学试剂三厂生产,批号20010108。 MDA，SOD测试盒，由南京建成生物工程研究所提供，批号20040421。鲎试剂药盒，由上海市医学化验所提供,批号为200403。1.1.2 动物Wistar雄性大鼠70只，体重180～220 g。由泸州医学院实验动物科提供，一级动物，合格证号240115。
1.1.3 仪器
全自动血生化分析仪，日本，AU2700型。752型紫外可见分光光度计，上海青华科技仪器有限公司产品。摄影生物学显微镜，日本Olympus，BH-2型。
1.2 方法
1.2.1 造模、给药及检测方法
取大鼠70只，随机分成6组，即空白对照组（10只，其余各组12只），模型组，灵芪蠲肝液大、中、小剂量组（LQL1，LQL2，LQL3）分别为8.5，4.25，2.125 g(生药)·kg-1·dl-1 (相当于临床用量的10，5，2.5倍)，用等容量给药法于每日晨按10 ml·kg-1灌胃,为排除灌胃对动物食欲的影响，模型组和空白对照组给予等容量蒸馏水，连续给药7 d，实验期间动物正常饮水，以标准颗粒饲料喂养。于给药第5天下午，对用药各组、模型组和阳性对照组给予硫代乙酰胺300 mg·kg-1腹腔注射，注射前禁食12 h始，注射后观察动物的一般情况及死亡情况。造模36 h后每组取10只大鼠用乙醚麻醉,心脏取血,分别分离血浆立即测ET，分离血清立即送检肝功，取肝组织在冰水中制成10%的匀浆送检MDA，SOD。并取肝组织做病理切片，在摄像生物学显微镜（100倍）下观察并摄像。ET的检测用偶氮显色法， MDA的测定用硫代巴比妥酸（TBA）法、SOD用黄嘌呤氧化酶法，具体操作按试剂盒说明进行。
1.2.2 统计处理计量资料以(±s)表示，用SPSS10.0软件包进行统计分析，行单因素方差分析,SNK法组间均值两两比较。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 动物的一般情况注射硫代乙酰胺6 h后，模型组大鼠出现精神萎靡，被毛蓬松，死亡1只；组情况较好，无大鼠死亡。
2.2 灵芪蠲肝液对硫代乙酰胺急性肝损伤大鼠肝功能的影响结果见表1。表1 灵芪蠲肝液对肝功能的影响(略)
2.3 灵芪蠲肝液对肝匀浆MDA，SOD和血浆ET的影响结果见表2。表2 灵芪蠲肝液对肝匀浆MDA，SOD和血浆ET的影响 (略)
2.4 肝组织病检查显微镜下，空白对照组肝组织结构清楚，肝细胞无变性、坏死及炎性细胞浸润。模型组结构破坏较明显，尤以中央静脉周围明显，肝细胞变性、溶解坏死、炎性细胞浸润明显。灵芪蠲肝液大、中剂量组肝组织结构部分破坏，肝细胞变性、坏死、炎性细胞浸润较模型组轻，尤其是大剂量组以水变性为主；灵芪蠲肝液小剂量组肝组织结构灶性坏死，仍以中央静脉周围为甚，肝细胞变性、坏死较模型组略有减轻；而阳性对照组肝组织结构部分破坏，肝细胞变性、坏死、出血较模型组略有减轻。
3 讨论
TAA的肝细胞毒性在于其激活肝细胞磷脂酶A2，使细胞膜上磷脂甘油基C2上的不饱和脂肪酰基被磷脂酶A2水解成溶血卵磷脂，使溶血卵磷脂增多，溶血卵磷脂可溶解细胞膜，从而造成肝细胞膜破坏，导致大面积肝细胞破坏［1］。TAA急性肝损伤模型组ALT，AST均明显增高，TBiL也明显增高，病理检查发现肝细胞变性、坏死严重，进一步说明肝细胞严重受损。由于TAA损伤肝细胞膜，通透性增加,细胞内转氨酶漏入血中，使血中转氨酶活性增高,而灵芪蠲肝液能明显降低ALT及AST，表明灵芪蠲肝液具有保护肝细胞膜作用，减少转氨酶释放，改善肝功能，能明显减轻肝损害，且大剂量灵芪蠲肝液能降低胆红素水平，说明其能促进胆汁排泄，降低高胆红素血症。故灵芪蠲肝液有保护急性肝损伤作用。
TAA模型组内毒素水平明显增加，有研究发现，TAA致急性肝损伤后大鼠肠黏膜固有层变薄，部分上皮细胞脱落，粘膜下淤血，淋巴细胞浸润增多，故认为肠粘膜屏障受损是导致肠源性内毒血症(IETM)的重要因素之一［2］，肠源性内毒素是引起体循环内毒素水平升高的最主要原因。在内毒素引起的肝损伤中，有大量的活性氧产生，活性氧不仅通过脂质过氧化等方式直接损伤肝实质细胞，亦可在内毒素对Kupffer细胞的激活过程中作为一个重要环节，通过破坏细胞氧化还原平衡，促使细胞分泌大量TNF-α等炎性因子，引起肝组织的损伤［3］。灵芪蠲肝液能降低内毒素水平，与模型组比较有显著性差异（P<0.05）,从而减轻内毒素对肝脏的损害。
氧自由基（OFR）触发的脂质过氧化反应是导致肝细胞损伤的重要机制。氧自由基可促使不饱和脂肪自由基形成，脂质自由基可引起细胞膜的流动性、通透性和完整性的破坏，进而使其双层结构发生断裂，引起膜镶嵌的一系列酶的排列紊乱、功能丧失、细胞能量产生系统瘫痪。因此测定血清、肝组织中脂质过氧化终产物MDA，可间接反应OFR对肝细胞的损害程度［4］。实验中，模型组肝匀浆中MDA含量明显升高，SOD活性明显降低，因为TAA所致的肝损伤中活性氧增多，对SOD的消耗增多及脂质过氧化产物增多。灵芪蠲肝液能降低MDA，增加SOD，说明其能降低氧化作用，增强抗氧化作用，使氧化与抗氧化趋于平衡，从而减轻肝损害。灵芪蠲肝液通过增强机体清除氧自由基能力，抗脂质过氧化而提高肝细胞膜系统的稳定性。
【】
［1］Osada J,Ayslgas H,Sanchez-Vegazo I.Effect of S-adenosy-L-methionine on thioace- tamide induced liver damage in rats［J］.Toxical letters,1986,32(1):97.
［2］黄建生，程娜，余叔佩.肝损伤后肠源性内毒素血症形成及影响的实验研究［J］.中华国际医学杂志，2003，3（5）：400.
［3］Malaidsse WJ, Nadi AB, Ladriere L,et al.Protective effects of succinic acid Di- methyl ester infusion in experimental endotoxemia［J］. Nutrition, 1997,13(4):330.
［4］杜东红，袁凤仪，何云.银杏制剂对大鼠急性肝损伤保护作用及机制［J］.世界华人消化杂志，2003，11（1）：85.
