柔肝散结法对肝癌大鼠干预作用的研究

【摘要】  　　目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF) 及环氧合酶-2（COX-2）在肝癌大鼠中的表达以及柔肝散结法对其表达的影响。方法40只雄性SD大鼠，随机分为空白组、模型组、青消方组、青消方防治组（简称“防治组”），每组10只。除空白组外，其余3组大鼠均以含0.05%2-AAF的饲料喂养12周，防治组在诱癌的同时灌服青消方。青消方组于诱癌第4周开始给药，剂量均为25 g·kg-1 ·d-1。12周末观察瘤体积及瘤重量的变化，并采用免疫组织化学方法检测各组大鼠标本中VEGF及COX-2的表达。结果模型组VEGF及COX-2的表达明显高于空白组(P<0.01)；青消方组、防治组VEGF及COX-2的表达明显低于模型组(P<0.01)；防治组优于青消方组。结论VEGF及COX-2在肝癌大鼠中表达增强，柔肝散结中药青消方能降低肝癌大鼠VEGF及 COX-2的表达，早期效果更佳。

【关键词】  柔肝散结法； 肝癌大鼠； 血管内皮生长因子； 环氧合

　　Abstract：ObjectiveTo approach the expression of the VEGF and COX-2 in rats with liver cancer and the effect of RouGanSanJie Fa(RGSJF) on it.Methods40 SD rats were divided into four groups at random:blank group, model group, QingXiao Fang group, FangZhi group, 10 rats in every group. Except for blank group, the other three groups were fed with bait vessel with 0.05% 2-AAF for 12 weeks. FanZhi group was lavaged with QingXiao Fang when cancer was induced. QingXiao Fang group 25 g·kg·d-1 was treated at the 4th week after cancer was induced. The volume and the weight of neoplasm were observed at the 12th week, and the expression of VEGF and COX-2 in every group was detected by immunehistochemical method.ResultsThe expression of VEGF and COX-2 in model group was obviously higher than that of blank group (P＜0.01). The expression of VEGF and COX-2 in QingXiao Fang group and FangZhi group was obviously lower than that of model group(P＜0.01), FangZhi group surpassed QingXiao Fang group.ConclusionThe expression of VEGF and COX-2 was augmented in rats with liver cancer, QingXiao Fang can depress the expression of VEGF and COX-2 in rats with liver cancer, especially at earlier period.

　　Key words：RouGanSanJie Fa;  Rats with liver cancer;  VEGF;  COX-2

    原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率占全部恶性肿瘤的第三位，易发生肝内外转移，预后较差。本实验利用肝癌大鼠模型，观察实验12周末瘤体积及瘤重量的变化，并采用免疫组织化学检测方法，检测血管内皮生长因子(VEGF)及环氧合酶-2（COX-2）在肝癌大鼠中的表达，探讨柔肝散结中药青消方对以上指标的干预作用，明确该方的部分作用途径及可能机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验用药

　　青消方（由太子参、白芍、绞股蓝、灵芝、冬凌草、鳖甲、蛇六谷等组成）由河北医科大学中门诊药房提供；2-乙酰氨基芴(2-AAF)：Sigma公司。

　　1.2  实验过程及观察指标

　　40只雄性SD大鼠，体重（120±10）g，随机分为空白组、模型组、青消方组、青消方防治组（简称“防治组”），每组10只。空白组以标准颗粒饲料喂养，其余3组大鼠均以含0.05%2-AAF的饲料喂养12周，防治组在诱癌的同时，灌服青消方25 g/（kg·d）。青消方组于诱癌第4周开始给药，剂量为25 g/(kg·d)。空白组和模型组给以等体积的蒸馏水。各组每日灌药3 h前后均禁食。12周末处死大鼠，解剖腹腔，取出肝脏，观察肝脏大体形态，测定瘤体积及瘤重量。各组用10%福尔马林液固定，石蜡包埋，制备成4 μm厚的切片，用于VEGF及COX-2免疫组织化学检测，明确其在蛋白方面的表达。

　　1.3  统计学处理

　　使用SPSS11.5 for windows统计软件，所有数据均用均数±标准差表示，采用单因素方差分析法对实验结果进行统计学分析。

　　2  结果

　　2.1  各组瘤体积和瘤重量的比较

　　青消方组、防治组与模型组相比，瘤体积缩小，瘤重量降低，有明显差异（P＜0.01）；防治组瘤体积缩小及瘤重量降低优于组青消方组（P＜0.01）。表1  实验末各组瘤体积及瘤重量的测定结果（略）

　　2.2  COX-2及VEGF免疫组化结果

　　VEGF及COX-2蛋白主要分布于细胞浆中， VEGF阳性细胞显示棕黄色或棕褐色颗粒；COX-2阳性结果呈棕黄色颗粒。4组大鼠每组选取10只大鼠标本，每个标本测量10个高倍镜视野。用阳性染色面积和显示屏面积的百分比表示该成分的相对含量。结果显示，模型组、青消方组及防治组VEGF和COX-2相对含量与空白组相比明显升高，有显著性差异（P＜0.01）；青消方组、防治组与模型组相比均明显降低，有显著性差异（P＜0.01）；防治组明显低于青消方组（P＜0.05）。表2  实验末各组肿瘤组织VEGF及COX-2的相对含量（略）

　　3  讨论

    研究表明，滋阴养血药物擅长保护骨髓功能，增加血液的白细胞、血红蛋白和血小板；软坚散结类药物能直接抑制、杀伤癌细胞，减少肿瘤细胞转移。因此我们采用具有益气柔肝、软坚散结作用的中药青消方为研究对象。青消方由太子参、白芍、绞股蓝、灵芝、冬凌草、鳖甲、蛇六谷等组成。药理研究显示蛇六谷具有明显抑瘤作用，在荷瘤小鼠体内有一定抑瘤率，达30.44%～42.25%［1］；绞股蓝的抗癌成分中，以20（S）原人参二醇抗肿瘤活性最高；从苦参中提取的苦参碱具有诱导肿瘤细胞分化、抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡等作用。
   
　　近年来研究表明，COX-2在绝大多数的肝细胞癌组织内呈过度表达［2］。COX-2与VEGF的研究主要集中在与肿瘤的发生的关系上［3］。本实验通过COX-2与VEGF在肝癌大鼠中的表达，探讨中药复方青消方在控制肿瘤发生、发展过程中的作用。研究表明，血管生成是肿瘤发生、发展过程中的重要步骤，与肿瘤的生物学行为及患者预后有关。VEGF通过与其受体结合，释放各种生长因子与细胞因子，促进内皮细胞的增殖与迁移，并通过VEGF的刺激促进肿瘤血管生成，增加血管通透性，协助肿瘤细胞进入脉管系统，促进肿瘤的侵袭及转移［4］。COX-2可通过刺激肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞的凋亡、抑制免疫应答等途径来促进肿瘤的发生和发展,并诱导VEGF的表达而促进肝细胞癌肿瘤血管的生成和侵袭转移［5］。
   
　　本实验结果表明，青消方组、防治组均能缩小肝癌大鼠瘤体积，减轻瘤重量，降低肝组织VEGF和COX-2相对含量，防治组明显优于青消方组。提示本病应早期，柔肝散结中药青消方具有一定防治作用。本实验结果为其临床应用提供了实验依据。

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  　　［1］陈培丰,刘鲁明.中药蛇六谷抗癌活性及诱导癌细胞凋亡［J］.中医基础医学杂志,2000,6（9）:30.

　　［2］韩少良,唐槐静,林东昕,等.肝细胞癌组织内COX-2表达的临床意义［J］.中华肝胆外科杂志,2002,8(5）:307.

　　［3］陈丽艳,胡双九.COX-2与VEGF的表达及相关性研究进展［J］.中国优生与遗传杂志,2005,13(6): 114.

　　［4］吴信华,姚登福,祝 勇,等.肝癌组织血管内皮生长因子表达水平的免疫组化研究［J］.胃肠病学和肝病学杂志,2003,12(5):447.

　　［5］彭利,左连富,王顺祥,等.肝癌组织中COX-2，VEGF，MMP-2，MMP-9的表达及相互关系的免疫组化研究［J］.实用肿瘤杂志,2005,20(2):134.