黄褐毛忍冬质量标准研究

                    作者：林廷龙，葛渝，刘志海，范红梅，邵红弱

【摘要】  　　目的 对黄褐毛忍冬进行鉴别、浸出物、含量测定特征研究，提高黄褐毛忍冬质量控制标准。方法采用薄层色谱法对黄褐毛忍冬中的绿原酸、咖啡酸进行鉴别；采用50%乙醇作溶剂，热浸法测定黄褐毛忍冬浸出物含量；以50%甲醇作溶剂，超声处理30 min制备样品溶液，采用高效液相色谱（HPLC）法，选用Luna〔5 μm,C18(2),250 mm×4.6mm〕色谱柱，体积流量1.0 ml/min，柱温30℃，检测波长327 nm，流动相为乙腈-0.4%磷酸（13：87）测定黄褐毛忍冬中绿原酸含量。结果采用薄层色谱法有效鉴别黄褐毛忍冬中的绿原酸、咖啡酸；采用50%乙醇热浸能控制黄褐毛忍冬浸出物含量；HPLC法测定黄褐毛忍冬中绿原酸含量，绿原酸在10.49～125.9 μg/ml范围内呈良好线性，R2=0.999 9，通过方法学考察，精密度、稳定性、重复性、回收率实验、耐用性实验RSD值均小于2.0%。结论建立了黄褐毛忍冬鉴别、浸出物、含量测定方法，能有效用于黄褐毛忍冬质量控制，为黄褐毛忍冬质量标准提高提供实验依据。

【关键词】  黄褐毛忍冬； 绿原酸； 鉴别； 浸出物； 高效液相色

　　Abstract：ObjectiveTo improve the quality control standard of Lonicera fulvotomentosa by mean of study on the  identifying character  and  soakings character and contents determining character of Lonicera fulvotomentosa.Methods1) Identifying the chlorogenic acid and coffee acid in Lonicera fulvotomentosa by thin layer chromatography;  2) Determining the extract contents of Lonicera fulvotomentosa with 50% ethanol solvent by hot soak;3) Determining the chlorogenic acid contents in Lonicera fulvotomentosa with HPLC and operating condition as follows: 50% carbinol solvent, 30 minutes treated by ultrasonic to  the samples, chromatographic column Luna(5 μm,C18(2),250 mm×4.6 mm), the volume flow was 1.0ml/min, the  column temperature was 30℃，the detection wavelength was 327nm，identifying and the mobile phase was acetonitrile -0.4% phosphoric acid（13：87）.Results1) The thin layer chromatography could identify the chlorogenic acid and coffee acid  in Lonicera fulvotomentosa effectively ; 2) The hot soaking with 50% Ethanol could control the extract contents in Lonicera fulvotomentosa; 3) When the chlorogenic acid contents was ranged  10.49～125.9 μg/ml,it showed good linearity,R2=0.999 9 with RSD＜2%.ConclusionThe identifying  method on Lonicera fulvotomentosa and the determining method on their extracts and the extract contents are established. These methods can effectively control the quality of Lonicera fulvotomentosa and so that they can supply the experiment  basis for improving the quality standard of Lonicera fulvotomentosa.

　　Key words：Lonicera fulvotomentosa;  Chlorogenic acid;  Identification;  Extract;  HPLC

    黄褐毛忍冬为忍冬科植物黄褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng.的干燥花蕾或带初开的花［1，2］，是20世纪70年代末发现的新种，首载于《植物分类学报》1979年17卷。在贵州省作为金银花使用，称“金银花”“毛金银花”“毛花”，地方习惯用于流行性感冒、咳嗽、肺炎等病［3］。《贵州省中药质量标准》1988年版、《贵州省中药材、民族药材质量标准》2003年版也将黄褐毛忍冬作为“金银花”“银花”收载［4，5］。但是对黄褐毛忍冬的特征性研究较少，质量标准亦较低，本课题结合我省资源情况对黄褐毛忍冬鉴别、浸出物、含量测定等方面进行质量标准的研究，进一步提高、完善黄褐毛忍冬质量标准，有效控制药品质量。

　　1  仪器与试药

    电热恒温鼓风干燥箱（GZX-9246MBE），电热恒温水浴锅（HH.SY11-Ni），高效液相色谱仪（Waters1525型及2487紫外检测仪），Luna〔5 μm,C18(2),250 mm×4.6 mm〕色谱柱，电光分析天平（TG328A），天平（JP-160）电热恒温鼓风干燥箱（GZX-9246MBE），电热恒温水浴锅（HH.SY11-Ni），绿原酸对照品（药品生物制品检定所 110753-200413）、咖啡酸对照品、甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），磷酸(分析纯)，娃哈哈纯净水。其余试剂为分析纯。黄褐毛忍冬样品由贵州飞龙雨公司提供。

　　2  方法与结果

　　2.1  黄褐毛忍冬绿原酸、咖啡酸成分［6］

　　鉴别研究取黄褐毛忍冬粉末0.2 g，加甲醇5 ml放置12 h，滤过，滤液作为供试品溶液。另取绿原酸、咖啡酸对照品分别加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液作为对照品溶液，照薄层色谱法试验［3］，吸取两种溶液各10 μl，分别点于同一聚酰胺薄膜薄层板上，以乙酸丁酯-甲酸-水（7：2.5：2.5）的上层溶液为展开剂，展开，取出晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点（图1）。

　　2.2  黄褐毛忍冬浸出物含量

　　研究考虑黄褐毛忍冬的药用方法和制剂提取的常规方法，《中国药典》2005版Ⅰ部附录Ⅹ A浸出物的测定方法，考察了水、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇4种溶剂的冷浸、热浸两种方法。测定10批样品，测定结果受两组变量A(浸出方法)、B（浸出溶剂）的影响，将浸出物含量、浸出方法、浸出溶剂应用SPSS统计软件进行方差分析。结果显示，应用水、50%乙醇、75%乙醇热浸，P=0.264＞0.05，结果无显著性差异，考虑各种因素，采用50%乙醇作溶剂，热浸法测定黄褐毛忍冬浸出物含量。

　　2.3  黄褐毛忍冬中绿原酸含量测定［7］研究

　　2.3.1  色谱条件

　　色谱系统由Wters1525型高效液相色谱仪及2487紫外检测仪；色谱条件：色谱柱为Luna〔5 μm,C18(2),250 mm×4.6 mm〕，流动相为乙腈-0.4%磷酸（13∶87），检测波长327 nm，柱温30℃，流速1 ml/min。测定方法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5～10 μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

　　2.3.2 对照品溶液的制备

　　取绿原酸对照品适量，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每毫升含40 μg的溶液，即得(10℃以下保存)。

　　2.3.3  供试品溶液的制备

　　取样品粉末（过四号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml，置25 ml棕色瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得。

　　2.3.4  线性关系的考察

　　取绿原酸标准品10.49 mg，加50%甲醇50制成0.209 8 mg/ml的母液，分别吸取母液配制成不同浓度的溶液，进样10 μl，按上述色谱条件测定，以对照品溶液含量（μg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标绿原酸的回归方程A=47 003C-38 602，R2=0.999 9，线性范围为10.49～125.9 μg/ml。

　　2.3.5  稳定性实验

　　精密吸取同一样品试液（样品编号No.9），分别于室温下0，1，3，6，12 h后进样，进样量10μl，分别记录绿原酸的峰面积，RSD值为0.80%，结果表明样品溶液在12 h内稳定性良好。

　　2.3.6  重复性实验

　　取同一批样品（样品编号No.9）按试液制备项下制备，平行制备样品试液6份，按样品测定项下方法测定峰面积，计算含量，RSD值为0.98%，结果表明本法重复性良好。

　　2.3.7  精密度实验

　　取绿原酸标准品（含量测定用）适量，制成40.25 μg/ml的溶液，连续进样5次，进样量10 μl，记录峰面积积分，RSD值为0.30%，结果表明绿原酸的进样精密度良好。

　　2.3.8  回收率实验

　　取已知含量的样品（样品编号No.9）精密称定（约0.25g）6份，分别加入一定量的绿原酸标准品（供含量测定用）按供试品溶液制备方法制备，按样品测定法测定绿原酸含量，计算回收率，结果平均回收率98.3%，RSD值为1.16%，表明绿原酸回收率较好。结果见表1。表1  黄褐毛忍冬回收率实验结果（略）

　　2.3.9  耐用性实验

　　取样品（样品编号No.2），按样品含量测定方法测定绿原酸峰面积，具体色谱条件：流动相乙腈-0.4%磷酸溶液（13：87），测定波长327 nm，流速1.0 ml/min，柱温30℃，色谱柱岛津Shim-pack  150l×4.6vp-ODS,进样量10 μl，测定绿原酸峰面积积分。同时按上述制备、测定方法考察柱温变化、流动相比例变化、不同品牌色谱柱和流动相流速变化对绿原酸峰面积积分的影响。
   
　　从考察以上四个方面的因素来看，除流速外，其余条件的改变RSD值均小于2.0%，符合HPLC条件的要求。而流速的改变，对照品的峰面积也成同样变化。因此可以判断：本方法测定黄褐毛忍冬中绿原酸含量的耐用性较好。

　　2.3.10  样品含量测定

　　按上述制备、测定方法测定10批20份样品。结果见表2。表2  10批黄褐毛忍冬绿原酸含量测定结果（略）

　　3  讨论

    在黄褐毛忍冬的贵州省质量标准中无化学成分鉴别，本方法用于化学成分鉴别简便快速。

    浸出物含量的测定是中药材内在质量控制的一个粗放的控制指标，本方法结合黄褐毛忍冬在实际使用和制剂生产中的特性，能简便易行的控制其内在质量。

    本方法通过测定黄褐毛忍冬中绿原酸的含量能有效地控制黄褐毛的质量，为提高黄褐毛忍冬的质量标准提供实验依据。

【】
  　　［1］植物志编委会.中国植物志，72卷［M］.北京：技术出版社，1988:231.

　　［2］贵州植物志编委会.贵州植物志，第2卷［M］.贵阳人民出版社，1985:229.

　　［3］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学出版社，2005:21，152，附录ⅥB.
　　
　　［4］贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准［S］.贵州科技出版社，2003:340.

　　［5］贵州省卫生厅.贵州省中药材质量标准，1988版［S］.贵阳：贵州人民出版社，1990:85.

　　［6］茅青，贾宪生.黄褐毛忍冬化学成分的研究［J］.药学学报，1989，24（4）：269.

　　［7］张艳焱，张天伦，梁光义，等.黄褐毛忍冬不同炮制品中绿原酸的HPLC法含量测定［J］.中草药，2003，31（8）：696.