开口箭皂苷对人神经胶质瘤细胞作用及相关机制研究

                     作者：蔡晶，雷林生，朱正光，迟德彪 

【摘要】  　　目的 探讨开口箭皂苷体外对人神经胶质瘤U251细胞的作用和其相关机制。方法开口箭皂苷作用于U251细胞后检测其IC50值。溶血实验观察开口箭皂苷对细胞膜的影响。提取U251细胞的DNA分析条带。RT-PCR技术检测开口箭皂苷对U251细胞的bax和bcl-2基因表达的影响。利用激光共聚焦显微技术研究开口箭皂苷对U251细胞内游离钙浓度和pH值的影响。结果开口箭皂苷对U251细胞的IC50值为8.5 μg/ml。不能引起肉眼可见的溶血现象。开口箭皂苷诱发了肿瘤细胞的凋亡，并引起了bax基因表达量的升高和bcl-2基因表达量的下降，并可引起U251细胞内游离钙浓度和pH值的降低。 结论 开口箭皂苷体外可以诱导U251细胞凋亡，其机制可能与上述实验结果有关。　

【关键词】  开口箭皂苷； U251细胞； 凋亡； 机制

　　Abstract：ObjectiveTo investigate the underlying mechanisms of STCB on the apoptotic induction of human neuroglioma cells. MethodsThe inhibitory effect of STCB on U251 cell line was studied. The haemolysis of STCB was observed. The differences of express of bax and bcl-2 genes was compared by RT-PCR. Laser confocal scanning microscopy was used to observe the effects of STCB on the intra-cellular  concentration of free cytosolic calcium and the hydrogenion concentration of U251 cells.ResultsThe 50%inhibiting concentration was 8.5μg/ml. STCB did not cause hemolytic crisis but induced the apoptosis of U251 cells with declining expression of bcl-2, raising expression of bax and decreasing of the intra-cellular  concentration of free cytosolic calcium and the hydrogenion concentration of U251 cells. ConclusionThe underlying mechanisms of STCB on the apoptotic induction of U251 cells may be associated with the results mentioned above.

　　Key words：STCB;   U251 cell;   Apoptosis；  Mechanisms

    开口箭 (Tupistra chinensis Baker)为百合科植物，其根茎具有清热利咽、活血止痛等功效［1～3］。在前期研究中发现提取其中的皂苷部位对小鼠S180肉瘤细胞具有生长抑制及诱导凋亡作用［1］。现进一步探讨开口箭皂苷（Saponin from Tupistra chinensis Baker，STCB）体外对人神经胶质瘤U251细胞的作用和其相关机制，现报道如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  药品与试剂

　　STCB由本实验室自行提取。RPMI-1640培养基，Gibco公司；新生牛血清，杭州市四季青生物工程材料有限公司；Hepes，FARCO化学品供应公司；四苯基氮唑蓝(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)，RNase A，PI（Propidium iodide），Sigma公司；荧光探针Fluo-3-AM,SNAFL（Seminaphthofluorescein），Molecular Probes Ins；HEPES，MDBio, Inc分装；DEPC，RT-PCR反应体系，杰特伟公司；oligod(T)18，TaKaRa；琼脂糖（Biowest Agarose）,上海YITO生物器材有限公司；溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB),上海博彩生物工程公司；引物为英骏公司合成。其余试剂均为分析纯。 

　　1.2  动物、瘤株与培养器材SPF级豚鼠5只，由南方医科大学实验动物中心提供。人神经胶质瘤U251细胞为本所保存。PETRI培养皿，Corning公司。

　　1.3  体外抗肿瘤细胞增殖实验采用MTT法［4］检测细胞增殖程度。在96孔板中分别加入不同浓度STCB和细胞悬液的混合液培养48 h后，每孔加入2.5 mg/ml MTT 20 μl，继续培养4h后弃去培养液，每孔加入150 μl DMSO振荡10 min后于酶标仪中以570 nm波长检测，测定各孔的光密度值(OD)。抑制率(%)=(1-加药孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100%。STCB对细胞的IC50值以Bliss法。

　　1.4  溶血指数测定根据记载［5］，取豚鼠全血配制成2%的血细胞悬液，以不同浓度的STCB生理盐水溶液和生理盐水等体积混合，混合均匀后置于室温下24 h后，肉眼和低倍镜下观察细胞溶血情况。

　　1.5  STCB对U251细胞DNA影响

　　以STCB（50 μg/ml）处理指数生长期U251细胞36 h，提取U251细胞DNA上1.5%琼脂糖凝胶电泳进行琼脂糖电泳片断化分析，在紫外灯下观察结果并拍照。

　　1.6   STCB对U251细胞［Ca2+］i的影响

　　Petri培养皿内细胞培养48 h，PBS漂洗后加入Fluo-3-AM 37℃避光孵育30 min，PBS漂洗后加入0.5 mlPBS上机检测，处理组加入浓度为50 μg/ml的STCB溶液 0.5 ml，观察其动态变化。

　　1.7  STCB对U251细胞内pH值的影响

　　Petri培养皿内细胞培养48 h，漂洗后加入SNAFL染液37℃避光孵育30 min，PBS漂洗后加入0.5 ml PBS上机检测，处理组加入浓度为50 μg/ml的STCB溶液 0.5 ml，观察其动态变化。

　　1.8  STCB对bax，bcl-2基因表达的影响

　　以STCB（50 μg/ml）分别处理指数生长期U251细胞12，24，36 h后，提取总RNA进行RT-PCR反应。分别取被检测基因bax，bcl-2和β-actin RT-PCR扩增产物上样于琼脂糖凝胶中电泳后，将凝胶转移至凝胶分析系统暗箱中，在紫外线照射下测定PCR扩增产物的荧光强度值（volume）。结果表示为：（被检测基因扩增产物荧光强度值/相应β-actin扩增产物荧光强度值）×100%。

　　1.9  统计学处理方法数据以±s表示，采用SPSS10.0软件，经方差齐性检验后对细胞内钙离子浓度变化和pH值变化行重复测量数据的方差分析，bax基因表达量变化和bcl-2基因表达量变化行配对t检验，以P＜0.05定为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  STCB体外抗U251细胞增殖的影响

　　实验结果提示STCB体外对U251细胞的增殖有抑制作用，且随浓度的增加OD570吸光度值相应下降，说明抑制作用相应提高。经，半效抑制浓度IC50值为8.5 μg/ml，其可信区间为4.63～12.66 μg/ml。

　　2.2 STCB的溶血作用

　　血细胞悬液与药物混合静置24h后，出现明显分层现象，上层透明无色，下层红色，肉眼观察下各浓度STCB给药组均未见明显溶血现象。

　　2.3  STCB对U251细胞DNA影响

　　U251细胞经STCB处理48 h后，诱导其DNA出现片断化，在琼脂糖凝胶电泳上呈现明显的“Ladder”条带。

　　2.4  STCB对U251细胞［Ca2+］i的影响以Fluo-3-AM为荧光探针, 进入细胞后，AM被胞浆水内脂酶水解，探针与［Ca2+］i结合后产生绿色荧光，其强度随胞浆［Ca2+］i浓度升降增强或减弱。扫描60 s后加入50 μg/ml STCB0.5 ml，可见荧光强度迅速减弱（图1）。

　　2.5 STCB对U251细胞膜内pH值的影响

　　以SNAFL为荧光探针，脂溶性的SNAFL进入细胞后，用LSCM检测的发出的红色荧光强度可显示细胞内的pH值水平。在60s以50μg/ml STCB刺激U251细胞，呈现荧光强度缓慢下降的趋势（图2）。

　　2.6  STCB对bax，bcl-2基因表达的影响

　　PCR结果如图3所示，bax基因表达量升高，bcl-2基因表达量下降，可见 U251细胞经过STCB处理之后，可促进bax基因表达并抑制bcl-2基因的表达。

　　3  讨论

    现知细胞死亡有两种形式：一种是人们所熟悉的坏死（necrosis），另一种是细胞凋亡（apoptosis）或程序性细胞死亡（programmed cell death）。细胞凋亡的机制极为复杂，迄今尚未完全阐明。细胞死亡是指细胞生命活动的结束，它和细胞生长一样，是机体生长发育和进行各种生理活动所必需的重要因素，在机体内通过一定的调节机制使细胞增生与死亡达到动态平衡。当调节机制紊乱时，两者之一的异常，均可引起机体疾病。凋亡细胞在核酸酶的作用下，其DNA 降解成寡核苷酸片段，在琼脂糖凝胶电泳中呈现阶梯状条带图谱，这些条带由不同倍数的180～200个碱基对的核普酸片段组成。在多数情况下，细胞凋亡为发生，但也可由一些生理性或毒性因子诱发。由于细胞凋亡是通过细胞内特殊的基因程序而发生，故又称程序性细胞死亡。细胞凋亡是机体的一种基本生理机制，并贯穿于机体的整个生命活动过程，包括胚胎的发育、新旧细胞的交替、某些组织的正常退化细胞凋亡时经历了许多重要的生理生化事件，如影响相关基因的表达量变化、细胞内线粒体功能紊乱、［Ca2+］i、pH值的改变等。
  
　　bcl-2(B cell lymphoma - 2 ,bcl-2) 基因是从滤泡性淋巴瘤相关的t (14 ;18) 染色体易位的断裂点部位克隆出的一种原癌基因［6］。随着对bcl - 2 基因的深入研究,人们发现bcl - 2并没有促进细胞增殖的能力,但它却能阻止细胞的凋亡,同时还发现bcl - 2 不仅与淋巴瘤有关,而且在许多恶性肿瘤中亦有明显的异常表达。bcl-2是一种凋亡抑制基因,可通过抑制诱导凋亡的信号而在肿瘤发生中起作用,它的过度表达可以防止由于去除生长因子而诱导的造血和神经细胞的凋亡,并且还防止或延长由辐射、糖皮质激素、热休克和多种化疗药物所诱导的凋亡。bcl-2可以通过改变胞内细胞器的钙流而抑制凋亡,钙离子可以激活与细胞凋亡密切相关的内源性核酸内酶。bcl-2可与bax 结合形成杂二聚体,以此来抑制bax的促凋亡作用。bcl-2和Bax都属于bcl-2 超家族的成员,是细胞凋亡途径中一组重要的调节基因。Bcl-2 能抑制细胞凋亡,为凋亡抑制相关基因;Bax 有促进凋亡的作用,为凋亡促进相关基因。促凋亡蛋白bax( bcl-2-associated protein x)，其分子大小为21 kDa，由192个氨基酸组成,与bcl-2 的氨基酸序列有21 %同源性,同bcl-2 共存于线粒体。两者及其家族其他成员共同构成了一个复杂的相互作用的,精细地调控着细胞凋亡。
   
　　激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）具有优良的空间和时间分辨率，结合荧光探针的应用使我们能对活细胞的各种功能进行精确的动态分析，本实验利用LSCM在亚细胞水平、从细胞生物学角度观察了STCB 对U251细胞MP［Ca2+］i等的影响，以探讨STCB诱导细胞凋亡可能的细胞生物学机制。
   
　　［Ca2+］i是信息传递的重要成员之一，细胞内的钙稳态对保持细胞的正常功能有很重要的作用,胞内钙离子浓度［Ca2+］i的升高或降低都能诱导细胞凋亡［7，8］。本实验结果显示：加入STCB后，U251细胞的［Ca2+］i迅速下降。正常细胞内与胞外［Ca2+］i浓度相差达104倍。加入STCB后却导致了Ca2+由膜内向膜外逆浓度转移，说明激活了Ca2+泵，至于是由于何原因引起，尚须进一步探讨。
   
　　pH调节是体内重要的生理过程。细胞内外pH瞬态变化、即H+的流动参与细胞的各种生物学过程。关于细胞凋亡与pH变化的研究很多，但结论尚存在分歧。罗健东等［9］认为细胞内酸化是细胞凋亡的重要环节，单纯碱处理通过减少细胞内酸化程度而呈现抗细胞凋亡作用；而黄行许等［10］在地塞米松诱导巨噬细胞凋亡的实验过程中发现，加药后细胞中胞浆首先出现碱化，随后又出现胞浆酸化；但也有人报道，在钙离子载体诱导HL-60细胞的凋亡及体外培养的胸腺细胞凋亡时，pH反而升高［11］。本实验结果表明，加入STCB后，pH呈现缓慢下降趋势，提示STCB可能引起U251细胞胞内环境的酸化。综合实验结果，STCB在体外可以显著抑制人神经胶质瘤细胞的增殖，主要是通过致凋亡作用来实现的。STCB可降低U251细胞的［Ca2+］i和细胞内的pH值。STCB的作用引起了bax基因表达量的上升和bcl-2基因表达量的下降。提示STCB诱导的细胞凋亡与上述生理生化事件相关，但何者为STCB诱导细胞凋亡的启动因素或主要因素，何者为继发事件，各事件之间的联系如何，尚待进一步实验研究证实。

【】
  　　［1］朱正光，余传林，蔡晶，等. 开口箭提取物的抗肿瘤作用研究［J］.中药材，2006，29（3）：277.

　　［2］庞晓军，符春晖，阳 明，等. 祛痰止咳合剂的抗炎与体外抗菌实验［J］.药通报, 2003,19(5):599.

　　［3］杨春艳，杨兴海，刘英，等. 开口箭祛痰、抗炎及抑菌实验研究［J］.中国民族民间医药杂志， 2005，73：103.

　　［4］庞建新，马仁强，刘兰梅，等. 博落回总碱对肝癌细胞的毒性作用和体内抗肿瘤作用［J］.南方医科大学学报， 2005，25（3）：325.

　　［5］郭承华，张恒云，刘丽娟.海燕组织中海星皂苷的分布及溶血指数的测定［J］.中国海洋药物，2000,3：12.

　　［6］Tsujimoto Y,Reed JC ,Alpers JD ,et al. Regulation of bcl - 2 proto- oncogene expression during normal human lymphocyte prolifer2ation Science ,1984 ,236 :1295.

　　［7］Antonsson B ,Conti F ,Ciavatta A ,et al. lnhibition of bax channel- forming activity by Bcl - 2. Science ,1997 ,277 :370.

　　［8］Naumovski L ,Cleary ML. The P53 - binding 53BP2 also inferactswith bcl - 2 and impedes cell cycle progression at G2/ M. Mol Cell Biol. 1996 ,16 :3884.

　　［9］罗建东，郑平香，陈 修.细胞内pH与细胞凋亡［J］.生命，1997，9（5）：218.

　　［10］黄行许，朴英杰，鲍永耀，等.共交镜观察凋亡巨噬细胞内pH的变化［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，1999，8（1）：37.

　　［11］姜泊.细胞凋亡基础与临床，第1版［M］.北京：人民军医出版社，1999：261.