复方茯苓甘草汤对肺动脉高压大鼠肺动脉转化生长因子β1表达的影响

【摘要】  【目的】观察复方茯苓甘草汤对肺动脉高压（PAH）大鼠肺动脉转化生长因子?β1(TGF?β1)表达的影响，以探讨该方防治肺动脉高压、肺血管重构的作用机理。【方法】选用30只SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型组、复方茯苓甘草汤组(中药组，剂量为5?46g·kg-1·d-1)；腹腔内一次性注射野百合碱（剂量为50mg/kg）造模，采用右心导管法检测大鼠平均肺动脉压(pmPA)；右心肥厚指数(p右心肥厚)；采用病理图像分析系统计量肺小动脉形态学指标，免疫组化法观察肺动脉中TGF?β1的表达。【结果】模型组大鼠pmPA、p右心肥厚显著升高，肌型动脉及部分肌型动脉比例增多，肌型动脉中膜面积与管腔面积比值（AM/AL）增大，肺动脉TGF?β1表达明显增多;复方茯苓甘草汤组上述各指标均有显著改善。【结论】复方茯苓甘草汤可有效降低肺动脉压、改善肺血管重构，其机理可能与抑制肺动脉TGF?β1的表达有关。

【关键词】  复方茯苓甘草汤/药；肺动脉高压/中药疗法；肺血管构型重建/中药疗法；肺组织/病理学；转化生长因子β;疾病模型，动物；大鼠

肺动脉高压(PAH)是临床众多心肺血管疾病发生的重要病理生理环节，在肺心病的发展过程中起着重要作用，长期肺动脉高压可致右心肥厚甚或功能衰竭。肺血管构型重建（PVSR）以肺血管壁细胞增殖，细胞外基质（ECM）合成增多，腺泡内无肌型动脉肌化、管壁增厚、管腔狭窄为主要特征，是造成肺血管阻力持续升高和肺动脉高压发生发展的主要原因［1-2］。转化生长因子?β(TGF?β)是一组多功能的多肽类生长因子，对细胞的增殖与分化、细胞外基质的产生、血管的生成、细胞凋亡及机体免疫系统均起着重要的调节作用［3］。我们既往的实验［4］表明复方茯苓甘草汤能降低肺动脉压，但机制仍不甚明了。本文观察了复方茯苓甘草汤对PAH大鼠肺动脉TGF?β1表达的影响，以探讨该方防治PAH、PVSR的作用机理，现报道如下。

    1材料与方法

    1?1药物复方茯苓甘草汤（茯苓、桂枝、炙甘草、桃仁、川贝母等）药材均购于广东医学院附属中药房，按组方比例称取，常规煎煮后配制成含生药546g/L药液。

    1?2主要仪器及试剂Leiea Q500IW图像分析系统（德国Leica公司）；Medlab?E生物信号采集处理系统（南京美易科技有限公司）；野百合碱（MCT，美国Sigma公司）；TGF?β1多克隆抗体（北京天来生物医学科技有限公司）；免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

    1?3实验动物及分组SPF级Sprague?Dawley系健康雄性大鼠30只，体质量(260±20)g，由广东医学院实验动物中心提供，合格证号：粤监证字2007A034。随机分为正常对照组(不造模，第2天开始给予生理盐水10mL/kg灌胃，每天1次，连续21d)、模型组(造模后第2天开始给予生理盐水10mL/kg灌胃，每天1次，连续21d)及复方茯苓甘草汤治疗组(中药组，造模后第2天开始给予中药5?46g·kg-1·d-1灌胃，连续21d)。

    1?4肺动脉高压模型复制［5］MCT用乙醇和生理盐水(体积比为2∶8)混合液配成10mg/L溶液，按50mg/kg腹腔内一次性注射。正常对照组注射等容积生理盐水代替MCT。

    1?5肺动脉压力及右心肥厚指数测定［6］借助右心导管与Medlab?E生物信号系统测量平均肺动脉压(pmPA)；取出心脏，剪除心房及血管，分离左、右心室及室间隔，冰盐水冼净及滤纸吸干后分别称量右心室自由壁质量(mRV)和左心室加室间隔质量(mLV+S)，计算右心肥厚指数p右心肥厚=mRV/mLV+S。

    1?6肺血管形态学指标的观测剪取完整右肺上叶，冰盐水洗净，除去血液，滤纸吸干，体积分数为10%中性甲醛溶液固定24h，常规梯度脱水、浸蜡、包埋、5μm连续切片、烤干，行苏木素—伊红（HE）及弹性纤维染色。显微镜下观察并计数整张切片中直径约30~200μm的肺血管肌型动脉(MA)、部分肌型动脉(PMA)、无肌型动脉(NMA)的数目，分别计算它们各占肺血管总数的百分比；每张切片随机选直径约30~200μm范围的肌型动脉各6支，用Leica Qwin图像分析系统测定中膜面积(AM，内外弹力层之间包围的面积)、管腔面积(AL，内弹力层包围面积)，计算中膜面积与管腔面积的比值(AM/AL)。

    1?7免疫组织化学检测参照试剂盒说明进行操作。肺动脉中TGF?β1表达的阳性信号为棕黄色沉淀。光镜下，每只大鼠选择血管外径为100μm左右的肺动脉进行半定量积分分析［7-8］。根据每条肺动脉中阳性信号表达的百分比，将其蛋白表达分为3个等级：(-)无表达；(+)1%~50%表达；(++)51%~100%表达。肺动脉中TGF?β1的表达进一步用积分值表示，即以某一反应强度的肺动脉的百分比乘以反应强度的加权值(“-”、“+”、“++”表达强度加权值分别为0、0?5、1?0)，每份标本至少检测10条血管。

    1?8统计学方法应用SPSS 13?0统计软件进行统计分析。

    2结果

    2?1各组大鼠平均肺动脉压及右心肥厚指数的变化表1结果显示，模型组pmPA、p右心肥厚均显著升高(P＜0?01)，中药组两指标与模型组比较均显著下降（P＜0?01）。各组大鼠肺动脉压力波形见图1。

    2?2各组大鼠肺小动脉病理形态观察图2（彩图页第102页）结果显示，正常对照组大鼠肺小动脉管壁菲薄；模型组大鼠肺小动脉管壁增厚，管腔狭窄；中药组肺小动脉管壁厚度及血管腔狭窄程度显著减轻。图3（彩图页第102页）结果显示，正常对照组大鼠肺小动脉管壁内、外弹力板间距离正常，中膜较薄；模型组大鼠肺小动脉内、外弹力板间距离明显增宽，管壁增厚，管腔狭窄；中药组则显著减轻。

    2?3各组大鼠肺组织MA、PMA、NMA所占比例的变化表2结果显示，模型组pMA、pPMA显著升高，pNMA显著降低(均P＜0?01)；中药组pMA、pPMA下降（P＜0?01），pNMA显著升高（P＜0?01）。

    2?4各组大鼠肺组织肌型动脉中膜面积与管腔面积比值的变化表3结果显示，模型组AM/AL显著升高(P＜0?01)，中药组AM/AL与模型组比较显著下降(P＜0?01)。

    2?5各组大鼠肺动脉TGF?β1蛋白表达的变化表4结果显示，模型组TGF?β1表达显著升高（P＜0?01），中药组TGF?β1，表达与模型组比较显著下降（P＜0?01）。各组大鼠肺动脉TGF?β1表达免疫组化染色见图4（彩图页第102页），结果显示血管壁中TGF?β1蛋白表达模型组比正常对照组增多，中药组TGF?β1蛋白表达较模型组减少。表1各组大鼠平均肺动脉压及右心肥厚指数的变化比较表2各组大鼠肺组织MA、PMA、NMA所占肺血管总数比例的变化比较表3各组大鼠肺组织肌型动脉中AM/AL的变化比较表4各组大鼠肺动脉TGF?β1蛋白表达的变化

    3讨论

　　中医中没有肺动脉高压、肺源性心脏病之说，而根据其临床表现如咳嗽、气短、动则气促、胸闷且痛、四肢厥冷或见浮肿、唇舌青紫、甚则“厥而心下悸”等，归属“肺胀”、“咳嗽”、“喘证”、“痰饮”、“水肿”、“心悸”等范畴。其多由痰浊潴留，肺气膹郁，壅滞迁延，久病肺虚所致。病变首先在肺，继则影响脾肾，甚至病及于心，而致心阳不振，血瘀不行，痰瘀交阻为患。痰瘀交阻乃贯穿始终的基本矛盾。复方茯苓甘草汤源自《伤寒论》中的茯苓甘草汤，“伤寒，厥而心下悸，宜先治水，当服茯苓甘草汤”。肺心病，常见厥而心下悸，肢厥是心排出血量低，心下悸即心窝下搏动，是肺换气功能障碍累及心脏的一个重要体征，因此茯苓甘草汤(茯苓、桂枝、炙甘草、生姜)，去生姜，以桂枝温通心阳，茯苓除心下悸之水饮，加用桃仁、川贝母等加强化痰解郁祛瘀而成复方茯苓甘草汤，全方能温阳利水，活血通脉，化痰祛瘀，以解除肺动脉高压、肺心病的“痰瘀交阻” 状态，使邪祛正安，病自向愈。本实验结果显示，中药组大鼠pmPA、p右心肥厚、肌型及部分肌型动脉比例、肌型动脉AM/AL值均较模型组下降，证实了该方防治PAH、PVSR的疗效。肺血管构型重建以肺血管中膜平滑肌细胞增生、肥大和外膜成纤维细胞增殖、细胞外基质增多所致的管壁增厚、管腔狭窄为特征［9］，是慢性肺动脉高压的主要病理形态学基础。TGF?β具有多种生物学功能，广泛参与体内各种病理生理过程，对细胞的增殖与分化、细胞外基质的产生、创伤愈合、胚胎发育、血管生成、纤维化、细胞凋亡及机体免疫系统均有重要作用［10］。已有研究表明［11-12］，TGF?β1 mRNA在肺动脉高压大鼠肺组织中表达增多，认为其可能通过促进成纤维细胞、平滑肌细胞增殖，促进细胞外基质合成等，参与肺动脉高压形成及肺血管构型重建。本实验模型组大鼠肺动脉TGF?β1表达显著升高，同样提示了TGF?β1在PAH、PVSR发病中可能起重要作用，可促进PVSR的形成。本实验结果表明，中药组大鼠pmPA显著下降，肺组织MA、PMA所占比例减少,肌型动脉AM/AL值缩小，同时肺动脉TGF?β1表达下降，由此推测复方茯苓甘草汤可能通过下调肺动脉TGF?β1的表达，一定程度地抑制肺动脉平滑肌细胞、成纤维细胞增殖，降低肺动脉ECM合成和异常沉积的作用，从而改善肺血管重建，降低肺动脉高压，其确切机制有待进一步研究。

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