肺康颗粒对慢阻肺模型大鼠气道重塑及转化生长因子β1的影响

                作者：刘建博，韩慧，杨桥榕，张玉芳，劳卫国

【摘要】  【目的】观察肺康颗粒对慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型大鼠气道重塑及转化生长因子?β1 (TGF?β1)的影响。【方法】将清洁级SD大鼠40只随机分为正常对照组、COPD模型组，肺康颗粒高、低剂量组（剂量分别为13、3?25g·kg-1·d-1），每组10只。采用熏香烟、气道内多次滴入脂多糖及灌服番泻叶法复制大鼠COPD肺脾两虚型模型。光镜下观察各组大鼠肺组织病理形态学变化并测量肺组织小气道管壁厚度；采用免疫组织化学法并结合图像分析技术测定大鼠肺组织、肺泡巨噬细胞、支气管黏膜上皮TGF?β1的表达。【结果】与正常对照组比较，模型组大鼠小气道管壁厚度及支气管肺组织TGF?β1的表达均有显著性升高（P＜0?05）；肺康颗粒高、低剂量组上述指标均显著低于模型组（P＜0?05）；但肺康颗粒高、低剂量组间支气管肺组织TGF?β1表达无显著性差异（P＞0?05）。模型组大鼠气道和肺组织出现慢性炎症改变和结构破坏，肺康颗粒高、低剂量组对上述病理变化有明显改善作用。【结论】肺康颗粒COPD的作用与其能在一定程度上改善模型大鼠的气道重塑，降低TGF?β1的表达有关。

【关键词】  慢性阻塞性肺疾病/中药疗法；肺康颗粒/药；气道重塑；肺组织/病理学；疾病模型，动物；大鼠

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是以不完全可逆气流受限为特征的疾病，其病理基础为气道壁和肺实质的慢性炎症及结构破坏，最终导致管腔狭窄、肺气肿形成和进行性气流阻力增加，这一过程称为气道重塑［1］。转化生长因子?β1（TGF?β1）是一种调节细胞增殖分化的多功能生长因子，对肺内支气管形态的变化，细胞外基质的产生及组织的纤维化等具有重要的作用［2］。有研究显示［3-4］，COPD患者支气管肺组织中TGF?β1表达明显升高。肺康颗粒是按本病“肺脾两虚，痰瘀内阻”的中医病机拟方，初步临床观察证明对COPD有较好疗效［5-6］。为进一步探讨其治疗作用的机制，本实验观察了肺康颗粒对COPD肺脾两虚型模型大鼠气道重塑及TGF?β1表达的影响，现报道如下。

    1材料与方法

    1?1动物及分组清洁级SD大鼠40只，鼠龄12周，体质量(200±20)g，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（粤）2003?0001，粤监证字2007A024。随机分为正常对照组、模型组、肺康颗粒高剂量组(中药高剂量组)及肺康颗粒低剂量组(中药低剂量组)，每组10只，雌雄各半。

    1?2主要试剂与仪器脂多糖由美国Sigma公司提供，批号：055:B5，用生理盐水配制为1mg/mL；TGF?β1检测试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA 0290；大前门牌香烟由上海卷烟厂生产，焦油含量23mg/支；EG1140型石蜡包埋机、2255型全自动石蜡切片机、TP1020型生物组织自动脱水机、5010型自动染色机均由德国徕卡公司提供；400型漂烘烤一体机（常州雅博公司）；生物组织显微镜（德国蔡氏）；微量有机分析专用超纯水机（颐洋有限公司）；恒温生化培养箱(宁波江南仪器厂)；TECAN TYPE酶标仪（Sunrise Remote/TonchScreen）；TDL?5?A型离心机（上海安亭）；UVmini?1240型紫外可见分光光度计（日本岛津）；自制密闭造模箱，大小50cm×50cm×50cm，木质箱体，透明有机玻璃箱盖，箱体壁留有4个直径1cm的通气孔。

    1?3药物肺康颗粒由黄芪15g、西洋参10g、茯苓15g、灵芝5g、丹参15g、甘草5g、法半夏10g等颗粒制剂及冬虫夏草菌粉2g组成。其中各颗粒制剂均购于广东一方制药有限公司，冬虫夏草菌粉购于杭州中美华东制药有限公司，产品批号分别为0706127、070828。将上述方药分别用200mL、50mL温开水溶解制成高、低剂量组肺康颗粒溶液。番泻叶浸液：番泻叶购于广州中医药大学第一附属门诊中药房，浸泡12h后，绞汁过滤，装入烧杯，放入40℃的恒温水浴箱中，浓缩至含生药1g/mL，4℃冰箱保存，使用前以0℃冰水混合物降温。

    1?4造模［7-8］及给药正常对照组置于室内正常喂养50d，不作任何干预。其他各组大鼠均采用熏吸香烟加气管内滴注脂多糖法复制肺虚型COPD模型，同时配合灌服番泻叶法复制脾虚型动物模型。具体方法如下：分别于实验第1、14天向气管内注入脂多糖0?2mL（1mg/mL）；第2～50天(第14天除外)上午将大鼠置于自制密闭造模箱内，注入大前门香烟烟雾，0?75h/d；第2～50天(第14天除外)中药高、低剂量组分别以13、3?25g·kg-1·d-1剂量于熏烟前2h灌胃给药；模型组以10mL/kg生理盐水灌胃；并自造模第20天开始，以1g/mL0℃番泻叶浸液(10mL/kg)于下午5时给大鼠灌胃，每日1次，持续30d。

    1?5观察指标及检测方法

    1?5?1一般情况观察大鼠一般情况，如大鼠的活动度、精神状况、毛发光泽度、体质量变化、口鼻分泌物、气喘、腹泻等。

    1?5?2标本的采集和处理于第51天，将大鼠股动脉放血处死，取其左侧肺组织及支气管、左右主支气管分叉以上约5mm的气管组织放入20mL体积分数为10%福尔马林液中充分固定 (24h以上)，固定后的标本经充分漂洗，脱水，石蜡包埋，切片。

    1?5?3肺组织病理学观察对肺组织进行苏木素—伊红(HE)染色，光镜下观察肺组织病理改变，观察内容包括：气管、支气管、小动脉平滑肌是否增生，管腔是否狭窄，细支气管及肺泡腔是否有渗出、水肿、出血或扩张，肺泡隔是否增厚，间质是否增生、水肿及炎细胞浸润等。

    1?5?4肺组织小气道管壁厚度的测量将经HE染色的石蜡切片置于40倍物镜下，随机取1个视野，利用测微尺，测量其中5个小气道的管壁厚度，每个气道分别测量3点钟及9点钟方向管壁厚度，每个标本共读出10个数值，取其平均值，进行统计学分析。

    1?5?5支气管肺组织的TGF?β1蛋白表达检测［9］采用链霉卵白素—生物素—酶复合物(SABC)法检测。结果判断：细胞相应部位（细胞核、细胞浆、细胞膜等）出现黄色反应为阳性，根据显色强度和阳性细胞数占总细胞数的比例两项指标判断阳性等级。按显色强度分为无色、淡黄、黄色、棕黄色，分别计为0、1、2、3分；按阳性细胞占总细胞数的比例分为0、＜1/3、1/3～2/3、＞2/3，分别计为0、1、2、3分 。将两项积分相乘，确定0分为阴性，1～3分为弱阳性，4～6分为中等阳性，7～9分为强阳性，分别计为-、+、++、+++。

    1?6统计学方法采用SPSS 11?5软件进行数据的统计分析。

    2结果

    2?1各组大鼠一般情况模型组大鼠活动明显减少，拱背蜷缩，体瘦，皮肤松弛，皮毛无光泽且脱落严重，大便质稀，纳食减少。于造模第15天即出现明显的咳嗽,鼻分泌物较多。造模30d后，模型组大鼠开始出现气喘，部分可闻及哮鸣音。正常对照组大鼠则活泼好动，体肥，皮毛亮泽，无明显咳嗽、气促、纳差、便溏等症状。中药高、低剂量组大鼠一般情况处于以上两组之间，两给药组间大鼠一般情况未见明显不同。

    2?2各组大鼠肺组织病理形态学观察结果正常组呼吸道及肺泡上皮结构完整，纤毛排列整齐，气管及各级支气管仅见散在的杯状细胞，未见腺体增生、管壁水肿及明显炎细胞浸润(彩图页第102页图1-a、图2-a)。模型组气管黏膜上皮部分脱落，杯状细胞及腺体增生肥大，管壁有以淋巴细胞、浆细胞为主的炎细胞浸润；支气管黏膜皱襞显著增多变长，突入管腔；平滑肌显著增生肥厚；小动脉血管平滑肌显著增生，管腔明显狭窄；终末细支气管远端狭窄，呼吸细支气管及肺泡管囊状扩张，肺泡膨大，泡壁变薄，呈小叶中央型肺气肿；部分周边肺组织肺泡扩大，呈肺泡型肺气肿(彩图页第102页图1-b、图2-b)。肺康颗粒高、低剂量组气管黏膜上皮部分脱落，杯状细胞及腺体增生肥大，管壁见少量淋巴细胞、浆细胞为主的炎细胞浸润；支气管黏膜皱襞轻度增多变长，突入管腔；呼吸细支气管及肺泡管部分扩张呈小囊状，部分肺泡膨大，泡壁变薄(彩图页第102页图1-c、d，图2-c、d)。

    2?3各组大鼠肺组织小气道管壁厚度比较表1结果显示，模型组大鼠肺组织小气道管壁厚度与正常对照组比较有显著性升高(P＜0?05)；中药高、低剂量组大鼠小气道管壁厚度显著低于模型组(P＜0?05)；中药高剂量降低小气道管壁厚度的作用优于中药低剂量组(P＜0?05)。

    2?4各组大鼠支气管、肺组织TGF?β1蛋白表达比较表2、表3及图3（彩图页第102页）结果显示，与正常对照组比较，模型组肺泡巨噬细胞、支气管黏膜上皮及肺组织TGF?β1蛋白表达强度与积分均有显著性升高(P＜0?05)。中药高、低剂量组支气管、肺组织TGF?β1蛋白表达强度与积分均显著低于模型组（P＜0?05）,但中药高、低剂量组间支气管、肺组织TGF?β1表达无显著性差异（P＞0?05）。表1各组大鼠肺组织小气道壁厚度比较表2各组大鼠支气管、肺组织的TGF?β1蛋白表达强度分级比较 表3各组大鼠支气管、肺组织的TGF?β1蛋白表达积分比较

    3讨论

　　COPD为肺科常见病、多发病，流行病学调查显示50岁以上男性发病率超过15%，是导致人类死亡的第4位病因。医学对COPD发作期的措施主要有氧疗、抗感染、止咳化痰、解痉平喘等，而对其缓解期的治疗缺乏手段。如何防止COPD的发生、阻止或延缓其是目前非常重要的研究课题。慢性气道阻塞性疾病及哮喘均存在气道重塑现象［10-12］，气道平滑肌增生、肥大，气道壁的增厚使气道在收缩时狭窄程度增加，因此气道重塑是此类疾病形成并迁延的病理基础［13］。研究显示气道重塑与TGF?β1通过诱导纤维母细胞增生、胶原纤维及细胞外基质合成增多等多种机制参与气道重塑［14］。TGF?β1是一种重要的致纤维化细胞因子，它除了具有增加细胞外基质沉积作用外，还具有促进气道平滑肌细胞增殖作用，因而在气道重建中具有双重作用［13］。TGF?β1参与了COPD发病的多个环节，其在肺组织表达增多不仅早于肺功能异常及病理形态异常，且与病情严重性呈正相关［15］。COPD在中医学中无相应病名，多属于咳嗽、喘证、肺胀等范畴。我们认为COPD主要中医病机乃“虚、痰、瘀”，为“本虚标实”之证。发作期以标实为主，缓解期以本虚为主。病人多嗜吸烟草，复感六淫之邪，肺气受伤，久病脾、肺、肾三脏功能失调，致水液停积为痰、为饮。而三脏之中，肺脏首当其冲，肺病及脾，脾运失司，脾土虚损，肺金亦无以生，遂致肺脾两虚，晚期可影响及肾；肺脾气虚，无力推动血行；痰饮形成，亦影响血液正常循行，则表现为“痰瘀内阻”。中医治疗主要针对“虚、痰、瘀”之病机，我们按“补脾益肺，佐以化痰活血”的治法拟方肺康颗粒，其中冬虫夏草具有保肺益肾、增强机体免疫力、抗炎、抗缺氧及止咳化痰和舒张支气管平滑肌等作用［16］。冬虫夏草菌粉能减轻COPD气道炎症的程度，有效阻止阻塞性肺气肿病理改变的进一步发展，并在一定程度上抑制肺功能的进行性恶化并改善其通气功能［17］。黄芪含有多种有效成分如黄芪多糖、葡萄糖醛酸、多种氨基酸、叶酸、黄芪苷等，具有免疫调节、保护细胞功能、抗氧化等功能［18］；能改善COPD患者肺部的炎症情况，减缓COPD患者的气道重构，延缓或阻止COPD疾病的发展［19］。此外，本方中西洋参、灵芝补益脾肺，茯苓、法半夏健脾燥湿化痰，丹参活血化瘀。全方标本兼顾，共奏补脾益肺、化痰活血之效。临床研究表明［20］，肺康颗粒具有补气固本、滋养五脏、止咳平喘等功效，并能促进消化和营养吸收功能，增强呼吸运动效率，减轻症状，从而改善COPD患者整体活动能力和生存质量。本实验采用持续熏香烟并多次气管滴注脂多糖的方法复制大鼠COPD模型，符合人类COPD发展过程；并结合灌服番泻叶泻下法复制大鼠脾虚模型，模拟人类COPD稳定期肺脾两虚证型。模型大鼠的支气管以及肺组织病理形态学改变显示出与COPD患者相似的病理结果；模型大鼠活动明显减少，拱背蜷缩，体瘦，皮肤松弛，皮毛无光泽且脱落严重，大便质稀，纳食减少等症状、体征表现符合肺脾虚证特点。结果显示本实验成功复制了符合要求的实验模型。本实验结果显示，中药组大鼠无论在一般情况、病理形态学变化，还是小气道管壁厚度及TGF?β1蛋白表达方面，较模型组大鼠均有明显改善，但尚未达到正常对照组水平。此结果还表明，肺康颗粒虽不能完全阻断COPD的形成，但其通过影响TGF?β1蛋白表达，可阻断气道重塑，改善COPD症状，延缓COPD发展过程。

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